核PKM2通过结肠直肠癌STAT3激活的上调促进易瑞沙（吉非替尼）抗性概述结直肠癌（CRC）是世界上最流行的恶性肿瘤之一。120多万个新的结
直肠癌病例和60只万人死亡，由于CRC的年度报告1。在过去的几十年中，CRC治疗已经发展成靶向特异性载体和联合细胞毒性治疗，而不是
单一药物化疗。易瑞沙（吉非替尼）（Iressa，ZD-1839）是靶向表皮生长因子受体（EGFR）信号转导途径的小分子酪氨酸激酶抑
制剂（TKI），其参与癌细胞的存活和增殖。在临床治疗方面，抗EGFR治疗策略被用作抗癌剂2。然而，最近的临床报告令人失望地表明，尽
管易瑞沙（吉非替尼）已经表明了一些针对CRC的抗肿瘤作用，新颖性的高水平的已经发生，响应于这种治疗3，4。因此，已经发现许多新的生
物标志物可以预测CRC患者对易瑞沙（吉非替尼）的反应。信号转导和转录激活因子3（STAT3）是转录因子STAT家族的成员，并在几种
癌症中被激活5。STAT3酪氨酸磷酸化可以通过上游受体和/或非受体激酶，包括EGFR，IL-6，和Janus活化激酶（JAK），和
Src家族激酶的活化来刺激6，7，8。STAT3的活化已与对EGFR-TKI电阻在神经胶质瘤和头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的临床
前模型相关联5，9。和在谁具有非小细胞肺癌（NSCLC）新辅助EGFR-TKI治疗的患者抗性与在肿瘤中升高的STAT3活性相关10
。这些累积结果表明，靶向STAT3可以克服癌细胞中EGFR-TKI的抗性。然而，STAT3不是用于CRC治疗的理想分子靶标，因为对
正常组织的潜在损伤和其他脱靶效应。高等。显示核丙酮酸激酶同种型M2（PKM2）调节CRC细胞中STAT3的组成型激活11。如果在易
瑞沙（吉非替尼）耐药性CRC细胞中表达核PKM2与易瑞沙（吉非替尼）敏感型CRC细胞相比表达差异，则核PKM2可能是易瑞沙（吉非替
尼）治疗的理想靶标。高等。显示核丙酮酸激酶同种型M2（PKM2）调节CRC细胞中STAT3的组成型激活11。如果在易瑞沙（吉非替尼
）耐药性CRC细胞中表达核PKM2与易瑞沙（吉非替尼）敏感的CRC细胞相比表达差异，则核PKM2可能是易瑞沙（吉非替尼）治疗的理想
靶标。高等。显示核丙酮酸激酶同种型M2（PKM2）调节CRC细胞中STAT3的组成型激活11。如果在易瑞沙（吉非替尼）耐药性CRC
细胞中表达核PKM2与易瑞沙（吉非替尼）敏感型CRC细胞相比表达差异，则核PKM2可能是易瑞沙（吉非替尼）治疗的理想靶标。丙糖酸激
酶（PK）在糖酵解途径的最后一步中起着限速酶的作用。该途径催化磷酸烯醇丙酮酸（PEP）转化为丙酮酸，其通过将磷酸酯从PEP转移到A
DP?12来实现。哺乳动物具有四种PK同种型（L，R，M1和M2），肝脏和红细胞是L和R同工型表达的位点。哺乳动物的大多数成体组织
表达M1同种型，而M2同种型是M1剪接产生的变体，在胚胎和肿瘤组织中表达13。催化活性PKM2是与糖酵解酶复合物14相互作用的四聚
体。在肿瘤细胞中，PKM2成为二聚体，似乎催化不能将PEP转化为丙酮酸15。已经提出，无活性PKM2有助于肿瘤进展，因为它将碳源从
糖酵解中间体引入生物合成。这特别影响细胞增殖所需的脂质，核酸和蛋白质的合成11。最近，几个独立的报告表明，PKM2定位于细胞核，响
应于各种信号16，17。核PKM2参与的目标，如OCT-4，HIF-1α，cyclinD1和c-Myc基因转录的调节18，19，
20。另外，PKM2的RNA干扰的抑制敏感胃癌和非小细胞肺癌细胞的细胞毒性药物21，22。在我们的研究中，我们显示核PKM2蛋白水
平与CRC细胞中的易瑞沙（吉非替尼）抗性相关，其由STAT3途径介导。通过共同靶向EGFR和STAT3磷酸化抑制易瑞沙（吉非替尼）
耐药CRC细胞在体内和体外的生长。这些观察结果表明核PKM2是致敏CRC细胞对EGFR-TKI治疗的可能分子靶点。结果核PKM2蛋
白水平与CRC细胞中的易瑞沙（吉非替尼）抗性相关为了了解核PKM2是否是易瑞沙（吉非替尼）耐药的可能靶标，采用六种CRC细胞系HT
29，SW480，SW620，LS174T，HCT116和C2BBel来评估易瑞沙（吉非替尼）耐药与核PKM2表达水平之间的相关性
。易瑞沙（吉非替尼）治疗后癌细胞的活力用MTS法测定。HT29，SW480和C2BBel是三种代表性的CRC细胞系，其对易瑞沙（吉
非替尼）的敏感性有显着差异，并从CRC细胞系中选择用于随后的研究（图1A）。使用蛋白质印迹分析在三种细胞系中测定PKM2表达水平。
增加的核PKM2水平不是由于细胞质提取物中PKM2，磷酸化-EGFR和总EGFR表达的变化（图1B）。用密度测定法分析核PKM2的
水平（ImageJ软件，Bethesda，MD，USA）。数据标准化为laminB。免疫印迹的半定量表明，核PKM2在C2BBe
l细胞中以最高水平表达，下一个最高水平在SW480和HT29细胞中（图1C）。核PKM2水平与接受易瑞沙（吉非替尼）治疗的CRC
细胞的IC50相关，相关系数（R?2）为0.9045（图1D）。免疫印迹的半定量表明，核PKM2在C2BBel细胞中以最高水平表达
，而下一个最高水平在SW480和HT29细胞中（图1C）。核PKM2水平与接受易瑞沙（吉非替尼）治疗的CRC细胞的IC50相关，
相关系数（R?2）为0.9045（图1D）。免疫印迹的半定量表明，核PKM2在C2BBel细胞中以最高水平表达，而下一个最高水平在
SW480和HT29细胞中（图1C）。核PKM2水平与接受易瑞沙（吉非替尼）治疗的CRC细胞的IC50相关，相关系数（R?2）为
0.9045（图1D）。图1CRC细胞系中的核PKM2表达与其对易瑞沙（吉非替尼）的耐药性相关。核PKM2蛋白水平在HT29细胞中
过表达，或者使用载体转染转染C2BBel细胞，以验证核PKM2在易瑞沙（吉非替尼）抗性中的作用（图1E，G）。还使用免疫荧光测定法
评估转染效率（补充图S1）。与具有核定位序列（NLS）突变转染细胞的PKM2载体相比，核PKM2的过表达使得HT29细胞对易瑞沙（
吉非替尼）更具抗性。相反地?，当用易瑞沙（吉非替尼）治疗非特异性shRNA转染的细胞时，PKM2的shRNA敲低具有显着增加C2B
Bel细胞的敏感性的作用（图1F??，H）。核PKM2增加易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞凋亡和细胞周期阻滞然而，核PKM2调节CRC
的易瑞沙（吉非替尼）抵抗力的机制需要进一步调查。为了确定核PKM2在CRC中的生物学意义，首先在过表达核PKM2的HT29细胞中分
析了易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞凋亡。用突变体-NLS载体感染的肿瘤细胞作为对照。流式细胞分析显示易瑞沙（吉非替尼）显着影响膜联蛋
白V的转换，这是细胞凋亡的指标;?核PKM2的过表达降低了HT29细胞系中膜联蛋白V阳性细胞的百分比（图2A和补充图S2A）。We
sternblotting分析表明，易瑞沙（吉非替尼）可以自发诱导PARP和caspase-3的切割，这是凋亡的标志物;图2核P
KM2的过表达抑制由易瑞沙（吉非替尼）诱导的CRC细胞的凋亡和细胞周期阻滞。作为核PKM2对CRC细胞凋亡的影响的证实，在用PKM
2shRNA载体转染的C2BBel细胞中分析易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞凋亡，用非特异性shRNA转染的肿瘤细胞作为对照。流式细
胞分析表明，转染PKM2shRNA载体诱导用易瑞沙（吉非替尼）治疗的膜联蛋白V阳性C2BBel细胞百分比增加（图2C和补充图S2
B）。此外，Western印迹分析表明，PKM2敲低可增强易瑞沙（吉非替尼）治疗诱导的切割的PARP和caspase-3的水平（图
2D）。这些观察表明核PKM2减弱了易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞凋亡。我们接下来研究了核PKM2对用DNA插入染料，碘化丙啶染色细
胞后的细胞周期的影响。CRC细胞对易瑞沙（吉非替尼）的敏感性可能是由于G1期细胞周期停滞。图2E，G显示核PKM2过表达使G1期的
易瑞沙（吉非替尼）治疗的HT29细胞数减少。此外，PKM2敲除显着改变了易瑞沙（吉非替尼）治疗的C2BBel细胞中细胞周期阶段的分
布（补充图S3A，B）。我们接下来检查了PKM2对细胞周期蛋白D1和p27Kip1的蛋白水平的影响，这两者都是细胞周期调节分子。W
esternblotting分析表明，用易瑞沙（吉非替尼）治疗的HT29细胞中，PKM2细胞核过度表达减弱了细胞周期蛋白D1和p
27Kip1的变化。细胞周期蛋白D1在用易瑞沙（吉非替尼）和PKM2shRNA联合治疗后显着下调，而细胞周期抑制剂p27Kip1
上调（图2F，H）。总之，这些数据显示核PKM2抑制易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞周期阻滞，并且与易瑞沙（吉非替尼）和PKM2s
hRNA的联合治疗显着促进易瑞沙（吉非替尼）耐药C2BBel细胞的细胞周期停滞。磷酸化STAT3水平与CRC细胞中易瑞沙（吉非替尼
）耐药相关，并由核PKM2调节STAT3磷酸化已牵涉于在人类HNSCC和易瑞沙（吉非替尼）NSCLC电阻5，10。因此，我们调查了
STAT3是否被核PKM2激活，并且参与CRC中的易瑞沙（吉非替尼）抗性。为了确定STAT3磷酸化与CRC细胞中易瑞沙（吉非替尼）
耐药的剂量反应关系，选择了三种CRC细胞系，包括HT29，SW480和C2BBel，用于实验。用或不用易瑞沙（吉非替尼）治疗测量三
种细胞系中的STAT3磷酸化。类似于核PKM2蛋白水平，STAT3磷酸化与CRC细胞中的易瑞沙（吉非替尼）敏感性高度相关（图3A）
。图3核PKM2诱导的STAT3磷酸化与CRC细胞中的易瑞沙（吉非替尼）抗性相关。为了确定核PKM2对CRC细胞STAT3激活调节
的机制，在核PKM2被敲低或过表达的CRC细胞中研究核PKM2对STAT3激活/磷酸化的影响。首先，我们的数据显示，与对照相比，核
PKM2转染细胞中STAT3磷酸化的上调发生;?然而，STAT3磷酸化在具有PKM2shRNA敲低的C2BBel细胞中下调（图3
B）。此外，共免疫沉淀测定显示PKM2与STAT3结合，但当细胞用易瑞沙（吉非替尼）治疗时，该关联性降低，这可能是由于STAT3激
活的减少。最后，我们在SW480细胞中创建了Flag标签的STAT3突变体（Y705A）和HA-NLS-PKM2，以确定STAT3
的Y705残基是否是PKM2的单一磷酸化位点。用Flag标记的STAT3突变体或内源性STAT3的免疫沉淀分析外源和内源表达STA
T3的活化。随后用抗磷酸酪氨酸的抗体进行免疫印迹。结果表明，内源性STAT3磷酸化，而外源表达的突变体没有显示任何磷酸化（图3D）
，这表明Y705是核提取物中PKM2的单个激活位点。核PKM2诱导的易瑞沙（吉非替尼）耐药依赖于STAT3STAT3在HT29细胞
中被抑制，使用siRNA或小分子抑制剂Stattic来证实STAT3在核PKM2诱导的易瑞沙（吉非替尼）抗性中的作用。使用蛋白质印
迹分析（图4A和补充图S4）证实了STAT3表达和磷酸化的成功抑制。根据MTS测定，根据STAT3的siRNA敲低后，在PKM2过
表达的核细胞中易瑞沙（吉非替尼）敏感性恢复，表明核PKM2诱导的易瑞沙（吉非替尼）抗性依赖于STAT3（图4B）。HT29/P
KM2-NLS细胞的STAT3消耗导致易瑞沙（吉非替尼）诱导的半胱天冬酶-3和PARP的分泌增加;?伴随着易瑞沙（吉非替尼）治疗的
HT29/PKM2-NLS细胞中膜联蛋白V阳性细胞的增加（图4C，D和补充图?S2C）。如图所示。4E，F，STAT3敲低显
着改变用易瑞沙（吉非替尼）治疗的HT29/PKM2-NLS细胞中的细胞周期停滞（见补充图S3C）。在易瑞沙（吉非替尼）治疗后，
STAT3siRNA导致细胞周期蛋白D1的下调和p27Kip1表达增加。该结果与早期数据一致，并显示核PKM2通过STAT3依赖
过程调节易瑞沙（吉非替尼）抗性。在易瑞沙（吉非替尼）治疗后，STAT3siRNA导致细胞周期蛋白D1的下调和p27Kip1表达增
加。该结果与早期数据一致，并显示核PKM2通过STAT3依赖过程调节易瑞沙（吉非替尼）抗性。在易瑞沙（吉非替尼）治疗后，STAT3
siRNA导致细胞周期蛋白D1的下调和p27Kip1表达增加。该结果与早期数据一致，并显示核PKM2通过STAT3依赖过程调节易
瑞沙（吉非替尼）抗性。图4核PKM2诱导的易瑞沙（吉非替尼）抗性由STAT3介导。核PKM2?在体内增加了易瑞沙（吉非替尼）的CR
C抗性在体内评估核PKM2对易瑞沙（吉非替尼）对CRC耐药性的影响，其中Balb/c裸鼠用作异种移植肿瘤模型。将过表达核PKM
2的HT29细胞皮下注射到裸鼠的双侧腋窝。7天后，当肿瘤明显可触及时，易瑞沙（吉非替尼）通过口服管饲以50mg/kg/天的剂
量施用。如图所示。如图5A所示，易瑞沙（吉非替尼）对核PKM2转染的HT29异种移植肿瘤的体积没有抑制作用。另外，易瑞沙（吉非替尼
）治疗组肿瘤生长速度明显高于对照组，这表明核PKM2对易瑞沙（吉非替尼）治疗有抵抗力。我们在小鼠异种移植模型中测试了核PKM2在C
2BBel细胞中的作用，以验证这些发现。毫不奇怪，PKM2敲低显着抑制易瑞沙（吉非替尼）耐药C2BBel异种移植瘤的生长（图5B
）。使用原位末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记（TUNEL）与过表达核PKM2的异种移植肿瘤的低温切片相比，与对照相比，TU
NEL阳性的细胞表现出更少的细胞，而PKM2敲低增加凋亡细胞的比例（图5D和补充图S5）。抗Ki67组织学分析显示，与易瑞沙（吉非
替尼）治疗后的PKM2-NLS-突变体肿瘤相比，核PKM2过度表达的肿瘤具有显着更高的增殖率。此外，PKM2敲低显着抑制易瑞沙（吉
非替尼）耐药C2BBel异种移植肿瘤的增殖（图5E和补充图S6）。此外，使用异种移植物和HT29/PKM2-NLS细胞的实验
表明，与单次给药相比，Stattic和易瑞沙（吉非替尼）联合治疗逆转了PKM2诱导的易瑞沙（吉非替尼）抗性和延缓肿瘤生长（图5C）
。这种协同作用可能是由于通过TUNEL和IF测定法测量的，正在进行凋亡的细胞数量增加和增殖细胞数量减少，图5核PKM2降低CRC细
胞对易瑞沙（吉非替尼）体内的敏感性。讨论尽管在许多研究中观察到抗EGFR疗法的抗肿瘤作用，但易瑞沙（吉非替尼）在转移性CRC?23
中临床无活性。几项研究表明，野生型KRAS，BRAF，PIK3CA和磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）蛋白预测了在一组CRC细胞系
中检测到的对西妥昔单抗的抗性。然而，这些生物标志物可能不会对CRC?24中的易瑞沙（吉非替尼）耐药有贡献。目前尚不知道阻止易瑞沙（
吉非替尼）治疗的基础分子机制。与gefinitib相关的高成本治疗和毒性需要更深入地了解治疗反应的分子和/或临床预测因素，从而可以
更好地选择治疗患者23。这里，我们确定CRC中增加的核PKM2表达是EGFR-TKIs固有抗性的潜在机制之一。我们的研究结果表明以
下模型：核PKM2的表达诱导STAT3信号的启动，其然后抵消EGFR-TKI对细胞凋亡和增殖的影响（图6）。我们在这里提出的模型
表明，靶向STAT3和EGFR激活可能是克服核PKM2诱导的CRC患者EGFR-TKIs抗性的有效策略。其然后抵消EGFR-TKI
对细胞凋亡和增殖的影响（图6）。我们在这里提出的模型表明，靶向STAT3和EGFR激活可能是克服核PKM2诱导的CRC患者EGF
R-TKIs抗性的有效策略。其然后抵消EGFR-TKI对细胞凋亡和增殖的影响（图6）。我们在这里提出的模型表明，靶向STAT3和
EGFR激活可能是克服核PKM2诱导的CRC患者EGFR-TKIs抗性的有效策略。图6图解说明PKM2对易瑞沙（吉非替尼）耐药的机
制。核PKM2水平与CRC细胞中的易瑞沙（吉非替尼）敏感性呈负相关，这支持了高核PKM2表达引起易瑞沙（吉非替尼）抗性的观点。与此
结果一致，我们发现HT29细胞中载体介导的核PKM2过度表达影响与异种移植小鼠模型中的对照相比，易瑞沙（吉非替尼）治疗效果和肿瘤体
积增加。相比之下，PKM2敲低具有改善易瑞沙（吉非替尼）治疗的效果，抑制肿瘤生长速度。由于许多报告表明，EGFR亚细胞分布到细胞核
可能在西妥昔单抗治疗性作用25，26。然而，CRC细胞中EGFR和吉非他坦耐药的数量之间没有关系。在我们的研究中，我们假设核PKM
2诱导的癌细胞增殖和存活影响易瑞沙（吉非替尼）在CRC中的抗癌效能，并进行实验来检验这一假设。我们的研究结果清楚地表明，HT29细
胞核PKM2过表达减弱了易瑞沙（吉非替尼）的细胞死亡和G1阻滞作用。如图所示图2和AND5，5，易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞凋亡和
细胞周期停滞，通过减少PKM2大幅上升，通过流式细胞术和细胞凋亡和细胞周期停滞标志物进行分析。这些结果表明，由核PKM2调节的p2
7Kip1和caspase-3通路在易瑞沙（吉非替尼）诱导的细胞生长抑制和凋亡中是重要的。STAT3途径在许多癌症类型中被激活，并
且与致癌转化，血管发生，侵袭和转移以及免疫系统抑制有关。几项研究已经在抗EGFR牵连STAT3激活27，28。在肝细胞癌，西妥昔单
抗抗性经由STAT3激活介导，和疗法，联合的STAT3抑制剂和EGFR表现出增强的生长抑制在体外29。在NSCLCs中，STAT3
激活赋予对易瑞沙（吉非替尼）的耐药性，这表明在对EGFR抑制剂不敏感的NSCLC患者中，STAT3靶向可能是替代疗法30。在高级胶
质瘤中，pSTAT3水平升高与化疗耐药有关，和STAT3信号传导的阻断敏感神经胶质瘤细胞对化疗，从而提供了使用靶向疗法的抗STAT
3的理由9。以前的研究表明，核PKM2通过在Y705?11磷酸化STAT3增强肿瘤细胞的增殖。此外，核PKM2依赖性β连环蛋白的反
式激活是必要的EGF促进的基因表达，细胞增殖和肿瘤发生20。然而，核PKM2诱导的STAT3磷酸化在易瑞沙（吉非替尼）敏感性调节中
的重要性是未知的。我们的观察结果表明核PKM2通过改变STAT3活性而不是在体外和体内增加STAT3蛋白表达来调节CRC细胞中易瑞
沙（吉非替尼）的耐药性。此外，PKM2与核中的STAT3物理结合，STAT3Y705是细胞核中唯一的磷酸化的PKM2位点。类似于
体外结果，表明抑制STAT3使HT29/PKM2-NLS细胞对易瑞沙（吉非替尼）敏感，Stattic和易瑞沙（吉非替尼）联合治
疗显着降低了HT29/PKM2-NLS异种移植瘤的生长，为组合治疗奠定了理论依据CRC类。我们的研究通过显示抑制PKM2的核功
能或破坏STAT3与PKM2在细胞核中的关联的分子，可以增加CRC细胞对易瑞沙（吉非替尼）的敏感性，从而创造克服易瑞沙（吉非替尼）
抗性的新途径。然而，核PKM2的易位抑制剂或破坏PKM2/STAT3结合的分子的安全性尚未得到评估。Ras/Raf/E
RK途径是参与易瑞沙（吉非替尼）耐药和细胞增殖的主要信号途径31。Lu组报道，ERK1/2通过S37?32磷酸化促进多形性成胶
质细胞瘤中PKM2向细胞核的迁移。ERK1/2与核PKM2共同作用以调节CRC细胞中的EGFR-TKI抗性尚不清楚。总之，我们
显示核PKM2过表达可能代表CRC患者内在EGFR-TKI抗性的新机制。我们的研究结果表明，STAT3和EGFR激活的共靶向可能是
治疗易瑞沙（吉非替尼）耐药性PKM2阳性CRC患者的理想方法。此外，由于STAT3介导核PKM2对易瑞沙（吉非替尼）抗性的控制，破
坏核PKM2与STAT3相互作用的小分子可能增强易瑞沙（吉非替尼）诱导的生长抑制和细胞凋亡，因此有助于提高EGFR-TKI治疗的疗
效。方法细胞系和试剂HT29，SW480，SW620，LS174T，HCT116，C2BBel和HEK293T细胞系购自ATCC（
AmericanTypeCultureCollection，Manassas，VA，USA）。将HT29，SW480，HCT
116和C2BBel细胞保持在补充有10％热灭活的胎牛血清（FBS，Invitrogen）的RPMI-1640培养基（Invitr
ogen，Carlsbad，CA，USA）中;?将LS174T和HEK293T保持在补充有10％FBS的Dulbecco改良的Ea
gle培养基（DMEM，Invitrogen）中，并将SW480细胞保持在补充有10％FBS的L15培养基（Invitrogen）
中。细胞在37℃和5％CO?2下孵育。从CellSignaling（Danvers，MA，USA）获得以下商业抗体：兔单克隆至P
KM2;?磷酸化STAT3（Y705）;?切割PARP;?切割的半胱天冬酶-3;?细胞周期蛋白D1;?p27Kip1;?和小鼠单克
隆至STAT3。在实验中使用的第二抗体是的IRDye??680驴抗小鼠IgG，的IRDye???800CW的山羊抗兔IgG（LI
-CORBiosciences公司，林肯，NE，USA），和AlexaFluor594山羊抗兔IgG（Invitrogen）
的。易瑞沙（吉非替尼）和STAT3抑制剂V（Stattic）购自SantaCruzBiotechnology（SantaCr
uz，CA，USA）。MTS测定以含有10％FBS的培养基将细胞以2,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。然后用相关试剂处理细
胞3天。我们根据制造商的方案，用MTS测定试剂盒（Promega，Madison，WI，USA）确定活细胞的数量。每个测定包括一式
三份，每次测定独立地重复至少三次。数据显示为从校正背景的吸光度计算的对照细胞的百分比。载体构建和转染为了构建NLS标记载体的野生型
和丙氨酸取代突变体，合成了与NLS标签（RRRHIVRKRTLRR）融合的全长人PKM2基因，并将其克隆入pLenti6.3-MC
S-IRES2-EGFP载体（Invitrogen），其用NheI和AscI消化。如上所述构建了Flag标记的STAT3载体的野
生型和磷酸-Y705突变体。为了构建PKM2shRNA载体，合成寡核苷酸（有义：5-CACCGCTGTGGCTCTAGACACT
AAACGAATTTAGTGTCTAGAGCCACAGC-3，反义：5-AAAAGCTGTGGCTCTAGACACTAAATTCG
TTTAGTGTCTAGAGCCACAGC-3），并在退火后克隆到pENTR/U6-GFP载体（Invitrogen）中。然后
将该产物通过LR反应重组，并亚克隆到pLenti6/Block-it-DEST载体（Invitrogen）中。为了实现稳定转染
，蛋白质印迹使用亚细胞蛋白分离试剂盒（ThermoScientific，Rockford，IL，USA）制备核蛋白提取物。8-1
2％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶用于蛋白质分辨。然后进行电渗析到硝酸纤维素膜（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。用特异
性抗体，随后的IRDye进行目的蛋白质的检测??680或的IRDye???800缀合的二抗。使用奥德赛红外成像系统（LI-COR
Biosciences）扫描印迹。免疫沉淀核蛋白提取物用蛋白A/G加珠（SantaCruzBiotechnology）预清
除。将来自每个样品的总共500μg蛋白质与指定的抗体在4℃下以1:100的稀释度孵育过夜。将蛋白质样品与15μl预清除的蛋白A/
G加珠子在4℃下进一步温育2小时，随后用非变性裂解缓冲液洗涤3次。然后如上所述用Western印迹测定法检测制备的样品。细胞凋亡
测定收集细胞，并以1×10?6个??细胞/ml的浓度重悬于1×结合缓冲液中。然后，将100μl细胞悬浮液在室温下在黑暗中用5μl
膜联蛋白V染色15分钟。染色后，将10μl碘化丙啶和400μl结合缓冲液加入到细胞悬浮液中，并使用FACSCalibur流式细胞仪
（BD，FranklinLakes，NJ，USA）分析混合物。细胞周期分析收集大约1×10?6个细胞，然后用75％冷乙醇在4℃下
固定过夜。通过向细胞中加入500μl碘化丙啶/核糖核酸酶（碘化丙啶的最终浓度：50μg/ml）进行DNA染色。通过FACStar
Plus双激光系统和FACSort系统（BD）测量每个细胞周期阶段中细胞的百分比。TUNEL和荧光免疫染色分析肿瘤的OCT嵌入切
片用4％多聚甲醛固定。用0.1％TritonX-100在柠檬酸钠中透化10分钟后，将载玻片用TUNEL反应混合物或一抗进行染色。
在摄影前，将每滴Vectashield安装介质与DAPI（VectorLaboratories，Burlingame，CA，US
A）相加。在显微镜下观察载玻片（LeicaDM2500，德国）。异种移植肿瘤模型四周龄的BALB/c裸鼠购自上海实验动物中心
（中国上海市）。所有动物工作均经仁济医院医学院伦理审查委员会批准，按照本委员会批准的指导原则处理。将总共?5×10?6个?PKM2
或PKM2敲低的肿瘤细胞皮下注射到无胸腺裸鼠的侧腹。当肿瘤体积达到约30-50mm?3时，每组5只小鼠以50mg/kg/天每
日口服剂量的易瑞沙（吉非替尼）4周。每周测量一次肿瘤体积（V），公式为：V=1/2（L×W?2），其中L为长度，W为宽度。在组
合治疗实验中，肿瘤大约30-50mm3后，将小鼠分成4组，每天用盐水（载体）处理4周;?（b）易瑞沙（吉非替尼）以50mg/
kg/天持续4周;?（c）以10mg/kg/天的方式统计4周;?和（d）易瑞沙（吉非替尼）以50mg/kg和Stat
tic每天10mg/kg持续4周。4周后，对小鼠进行安乐死，切除肿瘤。统计分析数据显示为平均值±标准偏差（SD）或标准误差（S
EM）。将所有分类数据与Fisher精确检验或X?2检验进行比较。使用Pearson分析分析核PKM2蛋白水平与易瑞沙（吉非替尼）
IC50之间的相关性。在适当的时候使用学生的t检验或Mann-WhitneyU检验。所有检查均为双侧，P??<0.05为重要检查
。附加信息如何引用本文：Li，Q.?etal。核PKM2通过结肠直肠癌STAT3激活的上调促进易瑞沙（吉非替尼）抗性。科学?代表
。?5，16082;?doi：10.1038/srep16082（2015）。补充材料补充资料：http://www.yiru
ishachina.com/templets/default/images/srep16082-s1.pdf点击这里查看（807K
，pdf）致谢拨款支持由中国国家自然科学基金（拨款号：81401735,81322025和81371875），创新研究组基金会（授
权号ZZjdyx13044），仁济医院（批准号：RJZZ13-014）提供，国家自然科学基金（No.81421001）。脚注作者
贡献?QL和DZ设计了该项目并进行了大部分实验;?XC，LH和TL进行了一些实验;?XX提供临床样品;?ML写了原稿，并对整个项目
进行了监督;?所有作者都审查了手稿。文章来源http://www.yiruishachina.com/a/news/54.html
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