高压均质与酶法相结合破碎裂殖壶菌_姜易彤 (1)

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TheKeyLaboratoryofCarbohydrateChemistryandBiotechnology,MinistryofEducation,

SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity(Wuxi214122)

AbstractSchizochytriumsp.isakindofidealnewresourcesofDHA.ItneedstobreakthecellofSchizochytrium

sp.toobtainDHAbecauseDHAisaproductoftheintracellular.Butatpresent,theefficiencyofthecelldisruption

methodsisnotsohigh.Themethodofhighpressurehomogenizationcombinedwithenzymaticdisruption

wasdiscussedinthestudy.Theresultsshowedthattheoptimalconditiontoachievethehighestcelldisruptionrate

wasasfollow;adding1.5%alcalase,pH10,temperature55℃,enzymolysistime1.5hafter50MPatwice

homogenizing,andthecelldisruptionrateofSchizochytriumsp.couldbeupto96.6%.Therefore,thiscombination

methodsignificantlyincreasedthecellbrokenratecomparedtosinglehighpressurehomogenization.

KeywordsSchizochytriumsp.;highpressurehomogenization;enzymaticdisruption;celldisruptionrate

裂殖壶菌（Schizochytrium）是属于真菌门、卵菌

纲、水霉目、破囊壶菌科的一类类藻的海洋真菌。该

菌细胞内积累了大量的油脂，90％以上的油脂以人体

易吸收的中性油脂-甘油三脂（TG）的形式存在

[1]

，

总脂肪酸中不饱和脂肪酸含量很高，主要为二十二碳

六烯酸（DHA，Docosahexaenoicacid，C

22∶6

，n-3）

和另外一种n-6PUFA（polyunsaturatedfattyacids），

其中DHA占总脂肪酸的30%～50%左右。近年来，作

为重要的n-3PUFA之一的DHA因其具有重要的生理意

义和经济价值而倍受人们的青睐。研究表明，它不仅

是婴幼儿大脑和视觉正常发育的必需物质

[2]

，而且还

具有治疗心血管疾病，抑制肿瘤及提高免疫力等多种

重要的生理功能

[3-5]

。随着渔业资源的日益紧张和生物

技术的发展，DHA的生产方式也实现了从传统的鱼油

提取向微生物发酵生产的转变。作为DHA新生资源之

一的裂殖壶菌DHA含量高，生长快，易于培养，对人

畜无害，其生产的富含DHA的单细胞油脂能够应用于

食品、化妆品、饲料添加剂以及保健品等领域，具有

极高的经济价值。

为了获得DHA，需要对裂殖壶菌细胞进行破碎。

在实际的DHA生产中，通常采用压榨和高压均质等技

术进行大规模的细胞破碎以释放胞内油脂，但高压均

质法单次破壁率低，在工业化生产中需要进行重复破

碎，并且均质机重复操作的损耗相当严重，影响大规

模的连续作业。酶法是利用生物酶对细胞壁膜的特定

组分进行降解破壁

[6]

。国内主要的DHA生产厂家中，

武汉友芝友保健乳品有限公司和湖北福星生物科技有

限公司已成功将酶法破碎应用于实际生产，并取得了

一定的经济效益

[7-8]

。酶法破壁虽然高效温和，破壁充

分彻底，但需要较长时间。目前，细胞破碎方法向多

种破碎方法相结合的方向发展

[9]

，复合法破碎细胞能

弥补单一破碎法的不足，起到“取长补短”的作用，

既能促进细胞内容物的溶出，又能达到高效经济的生

产目的。

本试验采用高压均质与酶法相结合的方法破碎裂

殖壶菌，先利用高压均质破坏细胞壁结构，降低细胞

壁的机械强度，消除酶与底物的空间位阻，然后采用

酶法处理，旨在找到高效，经济的细胞破碎方法，来

提高DHA油脂的产量与质量，降低生产成本，为DHA

的工业化生产提供相应的技术支持。





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裂殖壶菌：实验室保藏。





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固体培养基（GYP培养基）：葡萄糖2%，蛋白胨

1%，酵母粉0.5%，海水晶2%。

种子培养基：葡萄糖3%，酵母粉1%，海水晶

2%。

发酵培养基：葡萄糖13%，酵母粉0.3%，玉米浆

0.7%，海水晶2%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.4%。






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纤维素酶（酶活：10×10

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～140×10

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性蛋白酶（酶活：20×10

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U/g），碱性蛋白酶（酶

活：20×10

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～150×10

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U/g），木瓜蛋白酶（酶活：

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～150×10

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U/g）和糖化酶（酶活：20×10

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U/

g）：购于南宁东恒华道生物科技有限责任公司。





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HYQ-150S型全温摇床：武汉汇诚生物科技有

限公司；80-2离心机：常州国华电器有限公司；

BM100型光学显微镜：南京江南永新光学有限公司；

美国微射流Genizer高压均质机：上海慧翼流体设备

工程有限公司；SHZ-22水浴恒温振荡器：太仓市医

疗器械厂。






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菌种活化：将保藏于-80℃的菌种转接于斜面，

25℃培养3d进行活化。一级种子：用接种环挑取活

化的菌种，接入装有50mL种子培养基的250mL三角

瓶，置于摇床上，25℃，200r/min培养48h；二级种

子：取5mL的一级种子，接入装有100mL种子培养基

的500mL三角瓶，25℃，200r/min培养48h，然后按

10%的接种量接种到发酵培养基中，25℃，200r/min

培养7d。离心收集裂殖壶菌菌体，然后加入一定量的

无菌水，制成浓缩液，冷藏备用。






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干重法。





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取100mL裂殖壶菌浓缩发酵液，加等体积的水混

匀后置于均质机中均质两次，然后将均质后的发酵液

恒温水浴，用1mol/L的NaOH调节pH，加入适量酶，

振荡酶解一定时间。





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细胞计数法：利用显微镜，通过血球计数板计算

出反应前后细胞数即可。在血球计数时细胞基本保

持完整，记为一个；细胞正处于破壁阶段，记为半

个；细胞基本破壁完成，不计数。以此标准来计算破

壁率。

破壁率＝（1-A/B）×100%（1）

其中A为破碎后的细胞数，B为原始细胞数。





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取6份100mL裂殖壶菌浓缩发酵液，分别加等体

积的水混匀，按表1所示分别对其进行细胞破碎，选

取碱性蛋白酶进行酶处理，酶用量为生物量的1%，

调节发酵液pH为10，50℃恒温水浴，中速振荡酶解

2h，酶解结束后计算破碎率。

由表1可知，相比于单一的高压均质破碎细胞，

高压均质与酶法相结合破碎裂殖壶菌可以使细胞破

碎程度更彻底，在50MPa下高压均质后用碱性蛋白

酶处理，破碎率比单一的高压均质破碎细胞提高了

25.4%，而在30MPa和70MPa下，细胞破碎率分别提

高了17.5%和22.7%。此外细胞破碎率随均质压力的

升高而增大，但70MPa下的破碎率只比50MPa增加了

3.2%。综合考虑高压均质处理的压力和机器磨损，本

试验采用50MPa的均质压力。

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裂殖壶菌是海洋真菌，其细胞壁主要成分为多

糖、蛋白质和脂质等。因此本试验选用纤维素酶

（1），碱性蛋白酶（2），中性蛋白酶（3），木瓜

蛋白酶（4）和糖化酶（5）来考察不同种类的酶对细

胞破碎的影响。将上述五种酶按1%的添加量分别加

入到50MPa下均质两次后的发酵液中，在各自最适宜

的条件下酶解2h后计算破碎率，对裂殖壶菌的破碎效

果如图1所示

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从图1中可知，5种酶对裂殖壶菌破碎率的影响存

在明显差异。其中以碱性蛋白酶的破碎效果最好，破

碎率高达92%，其次为木瓜蛋白酶，破碎率比碱性蛋

白酶少7%，细胞破碎效果最差的为纤维素酶。





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选取细胞破碎效果较好的碱性蛋白酶，木瓜蛋白

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酶，中性蛋白酶中的一种或几种酶为主体酶，以纤维

素酶和葡聚糖酶为辅助酶按表2所示进行组合，选择

合适的酶解条件，对50MPa下均质两次后的发酵液进

行复合酶试验。用酶总量为1%。将碱性蛋白酶单一

处理做为对照，六组复合酶的处理与碱性蛋白酶单一

处理对裂殖壶菌细胞破碎程度的比较如图2所示。

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从图2中可知，除组合2破碎率高达93%外，各复

合酶组合破碎效果差异不显著，并且都低于碱性蛋白

酶单一处理的破碎率。这可能由于酶也是蛋白质，酶

与酶之间的相互作用会降低其他酶的活性，并且不同

的酶最适的pH和温度并不相同的缘故。组合2复合酶

处理裂殖壶菌的破碎率仅比碱性蛋白酶单一处理的破

碎率高1%，碱性蛋白酶为工业上最常用的蛋白酶，

来源丰富，价格低廉。因此本研究选用碱性蛋白酶为

试验所用酶。






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取高压均质处理后的发酵液，加入碱性蛋白酶进

行酶解试验，以裂殖壶菌破碎率为指标，通过四因素

三水平L

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（3

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）正交试验设计对酶解时间，pH，酶用

量和酶解温度进行选择优化。根据参考文献，所选的

正交试验因素水平见表3，结果分析见表4和表5。

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从表4和表5可知，酶解反应的4个因素均对裂殖

壶菌的破碎率产生影响，其中酶解温度和时间的影响

达到显著水平。各因素的主次顺序为酶解温度>酶解

时间>酶用量>pH，最优反应条件为A

2

B

3

C

2

D

2

，即酶解

时间1.5h，pH10，酶用量1.5%，酶解温度55℃。为

了验证正交试验分析的可靠性，对获得的最优酶解条

件进行重复验证试验，经过3次平行试验，得到的裂

殖壶菌破碎率分别为96.8%，97%，96%，平均值为

96.6%。

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以裂殖壶菌细胞破碎率来衡量细胞破碎效果，对

高压均质与酶法相结合的方法和高压均质单一破碎

进行比较，得到该复合法能显著提高细胞破碎率，

试验结果表明，裂殖壶菌发酵液经过50MPa均质后

再酶解，破碎率相比高压均质单一破碎细胞可提高

25.4%。研究了不同的酶对细胞破碎效果的影响，并

比较了复合酶对于单一酶的破碎效果，综合考虑选用

单一碱性蛋白酶为水解酶。采用正交试验设计对

50MPa均质后发酵液的酶解条件进行了选择优化。试

验结果表明，酶解反应的4个因素的主次顺序为酶解

温度>酶解时间>酶用量>pH，最优的酶解反应条件为

酶解温度55℃，pH10，酶用量1.5%、酶解时间

1.5h，在此酶解条件下裂殖壶菌破碎率可达96.6%。

该试验从节约生产成本，降低能耗，提高细胞破碎率

的角度出发，对工业化破碎裂殖壶菌生产DHA油脂起

到一定的参考作用。

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1.GuangxiUniversityofChineseMedicine(Nanning530001);

2.NanjingUniversityofChineseMedicine(Nanjing210029)

AbstractTodevelopedakindoffunctionfood,Fructushordeigerminatus,Crataeguspinnatifida,sugar,citric

acidandjellypowderetc.wereusedasrawmaterials.ThebestformulaofmoldingformulaofXiaoshihuajijelly

forchildrenwasdeterminedthroughorthogonaldesignandthesensoryevaluationasfollows:thequantityofex-

tractedsolution20%,sugar9%,citricacid0.3%andjellypowder6%.Themoldingformulaoptimizedbyorthogonal

designissimple,convenient,stableandfeasible.Thejellyhadgoodtasteanduniquebambooandbarleyflavour.

KeywordsXiaoshihuajijellyforchildren;moldingformula;orthogonaldesign

小儿消食化积膏是由炒山楂等几味中药组成的经

验方，具有消食健脾、理气化积等功效，主治小儿食

积气滞、消化不良、脘腹胀满、腹泻便溏等症。临床

上一直以汤剂的形式给药，疗效显著，深受患者欢

迎。但汤剂因服用不便，而且口感不佳，导致小儿服

用困难。现拟将其提取精制后制成保健食品，既保留

汤剂的原有优点，又弥补汤剂的不足，可大大提高小

儿患者的顺应性。本试验在小儿消食化积膏的最佳提

取工艺的基础上，采用L

9

（3

4

）正交试验进一步优选

成型配方，为其进一步的开发提供参考。





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BS224S电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有

 



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