氨基酸对映体的手性拆分

氨基酸对映体的手性拆分??氨基酸对映体的分离是生命科学的基础，在蛋白质多肽的研究、有机化学中的不对称合成以及医药、食品、卫生等领域都具有重
要意义。近年来，光学纯氨基酸在国际市场上的应用越来越广，如作为手性药物前体、保健品、氨基酸食品、化妆品等。1分离方法分离氨基
酸对映体的方法主要有高效毛细管电泳(HPCE)法、高效液相色谱(HPIC)法、薄层色谱(TLC)法和气相色谱(GC)法等。氨基酸
对映体在色谱分离前通常需要进行衍生化，衍生化的氨基酸对映体更适合于色谱分离，而且还能提高样品的检测灵敏度。1．1高效毛细管电泳
法(HPCE)高效毛细管电泳(HPCE)是近年来发展起来的一种新的分析技术，其特点是分离效率高(理论塔板数＞105?06)、灵敏
度高(可达10-19?021?mol)、应用范围广(从生物大分子到小分子、离子)、分析时间短(一般数分钟)、需要样品体积小(1?
50nl)、分离模式多。目前常用的手性氨基酸分析模式为毛细管区带电泳(CZE)和胶束电动色谱(MEKC)。1．2高效液相色
谱法(HPLC)高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效
亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。高效液相色谱分离手性物质的特点是灵敏、快速、分辨率高、重复性好、处理量大等。HPLC广泛用
于手性氨基酸的拆分。1．3薄层色谱法(TLC)薄层色谱法作为色谱分析的一个重要分支，具有快速、分离效率高、灵敏度高(薄层层析
可以检出0．01靏的物质)以及操作方便、无需任何设备、应用面广和既可进行定性鉴定亦可进行定量测定等优点，无须对样品进行任何预处理
即可取得较好效果。早在20世纪中叶，Kotake和Dalgliesh就利用薄层色谱法成功地拆分了手性氨基酸对映体。1．4气相色
谱法(GC)气相色谱分析是一种高效能、选择性好、灵敏度高、操作简单、应用广泛的分析、分离方法。气相色谱法分析氨基酸成本低，并且便
于与质谱联用，确定氨基酸的结构，从而有可能发现新的氨基酸或测定非蛋白质氨基酸，这是自动化氨基酸分析仪所不及的。1966年，Cil桝
v，Feibush，和Charles将手性氨基酸衍生化后，成功地利用气相色谱法进行了拆分。此后，气相色谱与液相色谱在对映体拆分方面
得到了综合发展。2分离机理在手性分离中可采取直接法和间接法2种途径，它们都涉及到非对映立体异构体的形成，不同的是所形成的非对
映立体异构体是否具有可逆性。2．1间接法采用间接法时，对映体首先与光学纯手性化合物进行化学反应生成一对非对映立体异构体，然后
再进行分离。此种方法分离的是衍生物而不是原对映体，可在非手性环境下用色谱法分离。间接法的优点是可采用通用的非手性柱分离，通过衍生化
可提高检测灵敏度，分离条件简单，分离效果好。其缺点是手性药物需要有被衍生化的基团，需要有高光学纯度的手性试剂，对各对映体衍生化速率
和平衡常数应一致，衍生化和色谱分离过程中不能发生消旋化。应用间接法拆分对映体已经有很长的历史了。2．2直接法直接法的分离原理
是手性对映体之一与手性固定相或手性流动相添加剂间发生分子间的三点作用，同时另一对映体则发生两点作用，形成非对映异构体的络合物，前者
较后者稳定，通过洗脱使两个对映异构体分离。直接法分离手性氨基酸对映体的优点是在分离前不需要进行衍生化反应，可根据手性固定相和手性流
动相选择不同溶剂体系做流动相。直接法又分为手性流动相和手性固定相2种方法。2．2．1手性流动相手性氨基酸对映体与加入到流动相
中的手性添加剂间形成非对映异构体复合物，再用非手性柱分离。这种方法只适用于HPCE、HPLC和TLC。因为在GC中，流动相气体为惰
性载体，能与之反应的氨基酸或固定相极少；而在HPCE、HPLC和TLC中，流动相是系统的动态部分，并与氨基酸和固定相互相影响。在该
方法中，对映体的分离取决于其与手性流动相所形成的非对映异构体络合物的稳定性。络合物的形成有3种途径：金属离子配合物(配体交换)、离
子对和包合物，Allenmark和Ahuja就这3种模式做了详细讨论。很多外消旋混合物可以通过添加适当的手性流动相在手性柱上得
到分离。手性试剂有釛、鈼、和銞环糊精等。该方法优点是可采用通用的色谱柱分离，手性试剂种类多，改变手性相可以得到不同的手性选择性；缺
点是手性试剂价格昂贵，操作条件复杂，分离后需要去除手性试剂。2．2．2手性固定相手性固定相(CSPs)直接与手性氨基酸消旋物
相互作用，其中一个生成稳定的暂时的对映体复合物，因复合物与非复合氨基酸在色谱洗脱时保留时间不同而得以分离。目前已知的可用于HPC
E、HPLC的手性固定相有100多种。Wainer按照手性氨基酸与手性固定相所生成的对映体复合物的类型，把手性固定相分为5类，即
Pirkle手性固定相、胶束手性固定相、包合手性固定相、配体交换手性固定相、蛋白质手性固定相。(1)Pirkle手性固定相该固
定相通过含末端羧基或异氰酸酯基手性前体与氨基键合硅胶进行缩合反应，分别形成含酰胺或脲型结构CSP。PirkleCSP5在手性氨基
酸分析中有广泛的应用范围，特别是分离极性芳香族化合物的对映体，大多使用非极性流动相，适用于正相色谱的分析。拆分机理是：①在外消旋物
的芳香环和PirkleCSPs间形成的∏棥羌虎谠赑irkleCSPs的仲胺或碳基与被分析物的酸性质子、羟基及氨基间形成的氢
键；②偶极-偶极作用；④范德华力作用。(2)纤维素手性固定相纤维素手性固定相是用不同方法将纤维素衍生物涂覆于大孔硅胶上而制得的
。在此类固定相上得到成功分离的化合物大都含有苯基、羰基、腈基、磺酰基或羟基等。目前，纤维素椚?3，5。二甲基苯基氨基甲酸酯)手性固
定相应用较多。未改性的纤维素能拆分氨基酸及其衍生物、二氨基羧酸以及生物碱等。衍生化的胶柬能分离很多外消旋化合物，Okamoto先在
纤维素外涂了一层三醋酸酯，再键合到硅胶上形成胶束，得到广泛应用。目前，常用由胆汁酸盐、氨基酸以及非离子型表面活性剂与SDS混合成胶
束体系来分离手性氨基酸。在分离DNS桝as时，DNS-基中的二甲基胺在酸性范围内被质子化，和脱氧牛磺胆酸盐侧链上的磺酸基的负电荷
发生静电结合作用，而氨基酸上的疏水性残基通常和胆汁酸盐胶束的疏水部分相互作用。Cohen用十二烷基桳棻?酸(SDALa)和SD
S混合胶束来分离几种氨基酸；Isi?hema则用甘草酸加SDS分离衍生化氨基酸。(3)包合手性固定相包合手性固定相的手性分离
是通过客体分子在空间上被主体分子包容形成络合物而实现的。主体分子外部的官能团起空间屏障作用，并能选择性地与客体分子作用。最常用的包
合CSPs是环糊精键合硅胶。环糊精的手性识别主要来自环内腔对芳烃或脂肪烃类侧链的包容作用，以及环外壳上的经基与药物对映体分子发生氢
键作用。不同的环糊精腔的大小不同，?环糊精手性键合固定相对形成包合物有最佳大小的内胺，适用于大多数对映体的位阻和电子特征，因而被广
为使用；釛环糊精适于分离小分子外消旋体；銞环糊精适于分离大分子。Armstrong进一步研究了环糊精作为手性固定相和流动相的应用。
环糊精在气相色谱和液相色谱中常作为手性固定相，在液相色谱、气相色谱和毛细管电泳中常用作手性流动相。冠醚也属于这一类CSPs，有亲
水性内腔和亲脂性外壳，可键合在硅胶或聚苯乙烯基质上制成手性固定相，根据主椏突г恚视糜诤心芄恢首?化的伯胺功能团的药物对映
体的分离，尤其是氨基酸及其衍生物的分离。18椆跅6椝聂人嶂饕糜?伯胺类物质的手性分离。Cram最早用冠醚分离了手性氨基酸和氨基
酯。Shinbo发现冠醚可以用于反相色谱柱分离多种手性氨基酸、氨基酯、氨基醇及胺类物质等。(4)配体交换手性固定相手性配体交换
是分离手性氨基酸的一种最早的方法，通常用Cu(H)金属离子和L型氨基酸或缩二氨酸的络合物作为手性添加剂，利用对映体选择性的过渡金
属络合物对溶质进行手性分离，对映体与过渡金属的络合物中的辅助配体进行交换。由于手性氨基酸、过渡金属及手性辅助配体形成的三元络合物的
稳定性不同而将对映体分离。常用的分离手性氨基酸的过渡金属络合物为Cu(H)桳桝sparame(天冬酰苯丙氨酸甲酪)。Cu(Ⅱ)桳桝
sparame中的L桝sp残基上的釛氨基和銞羧基与Cu(Ⅱ)发生整合作用，形成六元环配合物，而一般的氨基酸的釛氨基与羧基与Cu(Ⅱ
)螯合成五元环配合物。六元环配合物要比五元环配合物的稳定性差些。在有Cu(Ⅱ)(As?parame)2存在的电解质溶液中加入要分
离的氨基酸，一个分子的Asparame被氨基酸交换，形成三元络合物。络合物中，Asparame的L棻奖彼岵谢?氨基酸侧链基团
间的疏水作用是决定这个三元络合物的稳定性的主要因素。对于中性氨基酸，可将十四烷基硫酸钠(STS)引入电解质溶液，根据中性氨基酸溶解
于胶束相的程度不同而将之分离。通过改变实验条件如pH值、金属离子和配体的比例、温度、配体的种类及表面活性别，能够改变首先选择性。G
assmann首先以L椬榘彼嶙髋涮澹珻u(Ⅱ)作中心离子分离了10种丹酰化氨基酸。(5)蛋白质手性固定相蛋白质手性固定相是由
蛋白质与凝胶、硅胶微粒和糊精聚合物键合而成的，由于蛋白质中含有手性氨基酸，可对对映体在蛋白质的结合位置进行手性识别而达到分离目的。
可用于手性分离的蛋白质有牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、?椝嵝蕴堑鞍??梐cidglycopro-tein)、卵类粘蛋白(ovomucoid)、抗生物素蛋白(avi?din)、纤维素二糖水解酶(cellobiohydrolase)等。蛋白质手性固定相主要靠氢键及范德华力维持其稳定。可以通过调节流动相缓冲液的组成、pH值和温度来改变手性选择性。Stewart和Doheny最早利用琼脂糖键合牛血清蛋白(BSA)分离手性氨基酸。后来，Yang等用人血清蛋白做添加剂在10min内完成了色氨酸分离，并认为这种状态将适用于能和人血清蛋白结合的其它化合物。