中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2008Nov；24(11)：1513-7·1513·
蚤休醇提物对H202损伤
的ECV304细胞的细胞周期与凋亡的影响
高琳琳1，李福荣1，康莉1，司艳红1，王浩2，胡维诚3
(1．泰山医学院病理生理学教研室，山东泰安271000；
2．山东中医药大学基础It学院，山东济南250014；3．山东大学基础医学院，山东济南250012)
中国图书分类号：R284．1；R329．25；R329．28；R543．502．2；
R543．5053．1
文献标识码：A文章编号：1001—1978(2008)11—1513—05
摘要：目的制备中药蚤休醇提物，研究其对H：02诱导的
脐静脉内皮细胞(ECV304细胞)损伤的保护作用及其机制。
方法体外培养ECV304细胞，建立氧化损伤的细胞模型，
然后分为五个实验处理组：①正常对照组；②氧化损伤组；
③高浓度蚤休醇提物(EFB500ng·L。)组；④中浓度蚤休
醇提物(50ng·L“)组，⑤低浓度(5ng·L‘1)组。应用流
式细胞仪AnnexinV／PI染色检测该药物干预H：0：氧化损
收稿日期：2008—07—15，修回日期：2008一08—20
基金项目：山东省卫生厅青年项目基金资助项目(NoJZ43)；山东省
泰安市科技局科技基金资助项目(No20051011)
作者简介：高琳琳(1966一)，女，博士，副教授，研究方向：动脉粥样
硬化发病机制，Tel：0538_6225010，E-mail：眄ia99@126．
∞m：
王潘(1945一)，男，教授，博士生导师，研究方向：中西
医结合研究动脉粥样硬化发病机制，通讯作者，Tel：0531—
82613352。E—mail：waaghaoshenghua@hotmail．com
伤前后的细胞凋亡、PI染色检测细胞周期与凋亡的关系；
RT-PCR检测各实验组caspase-3mRNA表达的变化。结果
采用流式细胞仪Pl染色检测结果对细胞周期进行分析，
表明损伤作用于ECV-304细胞后，细胞在Go／G，期的数目
增多，在S期的数目减少，同时流式细胞仪检测可见亚二倍
体峰，而蚤休醇提物预处理以后，s期细胞数明显增多。流
式细胞仪AnnexinV／PI检测方法显示，损伤组的早期与晚期
凋亡率之和最高，预处理后细胞的早期与晚期凋亡率之和降
低。easpase-3mRNA水平在各实验组的表达显示损伤组与
内参照相比的灰度值最大，经过预处理之后其值明显下降
(P<0．01)。结论蚤休醇提物可以保护H：O：造成的
ECV304细胞的氧化损伤，是通过保护细胞周期正常进行、抑
制凋亡蛋白caspase-3介导的凋亡信号转导通路实现的。
关键词：内皮细胞；蚤休醇提物；氧化；损伤；细胞周期；凋亡；
caspase-3
动脉粥样硬化(AS)的发生机制存在多种假说，
目前占主导地位的“损伤一反应假说”和“炎症说”
PseudolaricacidBinducedapoptosisandmitoticarrest
circumventingFasreceptorpathwayinMCF-7cells
YUJing—hual，TASHIROShin—ichi2，ONODERASatoshi2，IKEJIMATakashil
(1．China一^lp帆ResearchInstituteofMedicalandPharttmceuticalSciences，ShenyangPharmaceuticalUni钟rsity，
Shenyang110016，China；2．DeptofClinicalandBiomedicalSciences，ShowaPharmaceuticalUniversity；Tokyo19—8543，Japan)
Abstract：AimTostudythemechanismsofPseudola-ner．At36h，PABup—regulatedtheexpressionofcdc
ticacidB(PAB)一inducedMCF-7cellapoptosisand2andnuclearcyclinB1．Fasantagonisticantibody
mitoticarrest．MethodsMTTassaywasperformedtoUB2hadnoeffectonapoptosis．butagonisticantibody
as$eSSthecellgrowthinhibition．contrastphasemicro-CH11enhancedtheapoptosisinducedbyPAB．UB2
scopeWaSusedtoobservecellularmorphologicahera．exceednoeffectoncellcyclearrest．andCHllhad
tion，andthechangeofDNAWasdetectedbyfluores·the8anleactionasUB2exceptforreducingthemitotic
centmicroscopy．Thedistributionofcellcyclewasde—arrestthroughenhancingapoptoticsubdiploidpeak．
terminedbyflowcytometricanalysisofpropidiumio-
didestaining，andtheproteinexpressionWasexamined
byWestemblotanalysis．ResultsPABinhibited
MCF-7cellgrowthinadose-andtime·-dependentnlan—
ner．4utool·L一1PABinducedDNAcondensationat
24h．PABcleavedPARPinatime—dependentnlan．
ConclusionPABinhibitedMCF-7cellgrowth
throughmitoticarrestandapeptosis．Apoptosisandmi—
toticarrestwereindependentofFaspathway．
Keywords：pseudolaricacidB：apoptosis；mitoticat-
rest；MCF-7cell
万方数据
·1514·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2008Nov；24(II)
认为…，内皮细胞损伤、中膜平滑肌细胞迁移和增
殖是AS发生的关键环节。近来许多研究证实了内
皮细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用。H：O：可促
进内皮细胞凋亡，而细胞凋亡在AS发生发展中起
着重要作用¨一1。
有报道【41发现含蚤休的方剂能够减轻高脂血
症大鼠动脉内皮细胞损伤，减少内皮细胞合成和释
放内皮素，具有保护动脉内皮细胞和抑制主动脉中
膜平滑肌增殖的功效，从而具有防治动脉粥样硬化
和高血压病的作用。为了进一步探讨中药蚤休对内
皮细胞损伤的抑制机制，本实验应用流式细胞仪
AnnexinV／PI染色检测脐静脉内皮细胞损伤前后各
组血管内皮细胞凋亡情况，PI染色检测损伤前后对
细胞周期的影响，RT．PCR检测凋亡相关蛋白
easpase-3mRNA的表达，旨在进一步探讨蚤休醇提
物对细胞损伤保护作用的机制及其之间的相互关
系。
1材料与方法
1．1材料人脐静脉内皮细胞株ECV304：购于武
汉大学典型培养物保藏中心；蚤休干片(购于济南
建联药店)，蚤休醇提物(EFB)为暗红色粉状结晶，
由泰山医学院药物化学教研室提取鉴定，每1kg蚤
休干片得到醇提物结晶1279，从蚤休干片的乙醇提
取物中分离并鉴定了重楼皂苷I、重楼皂苷Ⅱ等甾
体皂苷类化合物以及甾醇类成分和胡萝卜苷等成
分，纯度>95％。用RPMll640培养液稀释至500、
50、5ng·L～，微孔滤膜过滤除菌，一20℃保存备
用；碘化丙啶(PI)溶液(Sigma)；AnnexinV-FITC检
测试剂盒(购于北京宝赛生物技术有限公司)，其他
试剂购于济南联星生物试剂公司。
1．2实验方法
1．2．1细胞培养及干预将ECV304细胞在37℃，
5％CO，条件下培养，以含10％FBS的RPMll640
培养液调整细胞密度至l×108·L～，按每瓶2rnl
接种于25rnl的细胞培养瓶，每48h更换培养液1
次。待细胞融合率为70％～80％时，无血清培养12
h后使细胞同步化于G0期，然后按分组分别加药进
行预处理24h，再加入氧化损伤药物H：O：，终浓度
为100p,mol·L～，作用12h。细胞分组如下：正常
对照组：不加任何药物的培养基；氧化损伤组：H：O：
终浓度为100p．mol·L～；蚤休醇提物高、中、低剂
量预处理组：(500、50、5ng·L。1)，调整各组细胞
浓度为5×10’～5×10’·L～。
1．2．2流式细胞仪PI染色分析各实验组细胞周期
变化37℃温箱取出各处理组细胞培养瓶，胰蛋白
酶消化，分别收集细胞放入试管中。将试管以1000
r·min。1分离心5min，弃上清液，加入4℃PBS，涡
旋方式混匀，再离心，洗涤细胞2次。将4。C70％的
乙醇约0．5ml贴壁缓慢加入试管中，固定细胞。以
1800r·min。1离心细胞悬浮液5min，倾去固定液。
再加PBS离心洗涤细胞1次。每106细胞／IId加入
500U的RNA酶，使终浓度为50mg·L～，37℃保
温30min。离心去除RNA酶，再经PBS洗1次，去
上清液。每106细胞加50mg·L一的PIlIrIl，室温
下避光染色20rain以后。300目尼龙网过滤。上流
式细胞仪测定(激发波长488nm，氢离子激光)，用
muhcyeleDNA分析软件包进行细胞周期分析。
1．2．3流式细胞仪AnnexinV／PI双染分析细胞凋
亡率取1ml细胞，1000r·rain一，4℃离心lO
min，弃上清；加入1IIll冷的PBS，轻轻震荡使细胞
悬浮；l000r·rain～，4℃离心10rain，弃上清，重复
2次；将细胞悬浮于200斗l的BindingBuffer；加入
10山AnnexinV-FITC和5山PI，轻轻混匀，避光室
温反应15min；加入300山的BindingBuffer后用流
式细胞仪检测(Ex=488nm；Em=530am)细胞凋
亡的情况，按照文献报道判定早期以及晚期凋亡
率‘引。
‘
1．2．4RT．PCR方法测定各实验组ECV304细胞中
easpase-3mRNA的表达弃干净培养瓶中的培养
液，每瓶细胞加入1mlRNA提取液，然后依次用氯
仿、异丙醇萃取，得到的RNA沉淀物用分光光度仪
测260nm和280am吸光值，计算RNA浓度。按如
下体系进行逆转录：RNA2trg，寡核苷酸引物1止，
RNasin1山，5×缓冲液6一，dNTP2一、AMV逆转
录酶(Promega公司)40U，用去RNA酶三蒸水补足
至25一，42℃1h，70℃15rain。得到的eDNA保存
于一20。C。采用软件premier5和primer3分别设计
其上下游引物，引物由大连宝生物公司合成。内参
照为B-aetin，引物序列为正义链5''-CTCGGTCTGG-
TACAGATGTCGATG-3’，反义链5’一GGTrAAC-
CCGGGTAAGAAl．G1’GCA-3’。聚合酶链反应体系为
eDNA模板2一、dNTP1山，10×缓冲液5一，25
mmol·L～MgCl23山，寡核苷酸引物20pmol·
L～，Taq酶1一，灭菌三蒸水补足至50斗l混匀。
94℃预变性300s，然后94℃变性30s一+58℃退火
60¨72℃延伸90s，30个循环，最后延伸600s。
琼脂糖凝胶电泳分析结果。
1．3统计学处理实验数据以x±s表示。采用
SPSS12．0软件包分析对实验数据进行One·way
ANOVA分析及LSD两两比较。
万方数据
中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2008Nov；24(11)·1515·
Fig1FCI～!I)IhIApIo埘aJuilyaen鲫舭缸枷groups
A．Normlcontrol；B：蜘ttrygroulD；C：EFB500rig·L一1；D：EFB50lag·L一1；E：EFB5ng·L一1
2结果
2．1实验各组药物对ECV304细胞细胞周期的影
响各实验组DNA倍体分析图可见，仅损伤组在
Go／G．期之前出现明显的亚二倍体，提示有凋亡现
象。对各组s期、Go／G，期细胞的百分比进行统计
学分析，方差分析的结果：P=0．001，说明各组间的
差异有统计学意义。LSD进行两两比较，损伤组G。／
G。期细胞比例高于对照组、S期细胞百分比低于对
照组(P
G。／G，期细胞比例低于对照组、s期细胞百分比高于
对照组(P<0．01)，且蚤休醇提物高、低浓度药物组
的Go／G．期与正常对照组差异无统计学意义(P>
0．05)。见流式细胞仪PI染色DNA倍体分析结果
(Fig1)及统计分析结果(Tab1)。
T曲1EtYeetsofm蚰130／GiandSstage
incellcycle(x-I-5，n=5)
GroupG／GlsG2／M
Normal52．84±4．7639．09±3．76”10．07±1．01
Illju玎62．26±5．12’‘25．68±1．8912．17±1．25
EFB500rig·L“50．13±4．7537．67±2．54”12．2±1．17
EFB50ng·L。138．99±3．3t149．88±4．75#11．14±O．87
EFB5峭-L’155．91±5．7235．69±4．08”8．39±O．92
。。P<0．01踯control：”尸<0．01∞injury
2．2实验各组药物对ECV304细胞凋亡的影响
按照AnnexinV／PI-FITC荧光染色结果的判定标准，
早期与晚期凋亡率即第二象限与第三象限之和，对
实验散点图相应数据进行统计学分析，结果显示，正
常对照组的为(22．75±2．14)％，而损伤组达(43．18
±3．58)％，损伤组凋亡率比对照组明显增加(P<
0．01)，而各蚤休醇提物组预处理后分别为(23．57±
1．98)％、(24．64±2．40)％、(27．35±2．77)％，与损
伤组相比均明显下降(P<0．01)；并且高、中浓度预
处理组与正常组相比差异无显著性(P>0．05)。见
Fig2，3。
2．3实验各组药物对ECV304细胞c嬲pa∞．3mR-
NA的表达的影响e鹪pase-3的扩增产物的大小为
533bp，H202刺激损伤后，c嬲p蹴-3mRNA的表达量
与内参照灰度值之比最大(Fig4)，与正常对照组相
比明显增加(P<0．01)，而各蚤休醇提物预处理组
easpase-3mRNA的表达量减少，与损伤组相比差异
有显著性(P<0．01)，并且在高浓度预处理组表达
低于低浓度预处理组(P<0．01)，见Tab2。
Tab2‰0f啪蚰伪甲糯omRNA既p触inIhced
byH20z(i±5，，l=5)
Group
N∞nal
InjIlly
EFB500ntg·L一1
EFB50rig·L‘1
EFB5llg·L“
c∞p舶e．3mBNAexpression
14．58±1．19
32．21±4．15’‘
21．22±3．63。●△△
25．14±2．7l钟
26．89±0．79”
’‘P<0．01懈control；辨P<0．01蟠injury；△△P
万方数据
·1516·中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2008Nov；24(11)
Fig2AnaytleresultofEFBonearlyandlateapopto幽rate
A：Normalcontrol；B：hjurygroup；C：EFB500ng·L。；D：EFB50rig·
L～：E：EFB5ng·L‘1
ABCDE
Fig3Arm蚶cresultofEFBonearlyand
lateapoptosisrate(；±5，n=5)
A：Normalcontrol；B：Injurygroup；C：EFB500ng·L‘1；D：EFB50
ng·L一1；E：EFB5ng·L～．’’P
蜘ury
3讨论
蚤休，又称七叶一枝花。其基源为百合科重楼
属的多种植物。药用历史悠久，其以蚤休之名首载
于《神农本草经》，《唐本草》申录别名为重楼。是传
rig4TheeffectofEFBonthemRNAexpression
ofcaspase-3ofECV304inducedbyH202
M：Marker；A：Normalcontrol；B：tnjurygroup；C：EFB500ng·
L～；D：EFB50ng·L～；E：EFB5ng·L。1
统的清热解毒类药物。蚤休的药理活性多样，近年
来国内外学者着眼于其生理活性和独特的药用价
值【6】，运用现代药理方法，为中药蚤休的一些临床应
用提供了理论依据，同时也发现了它的一些新作用。
本研究首次在保护内皮细胞氧化损伤的角度，探讨
蚤休醇提物对细胞周期与凋亡的影响。
细胞凋亡是受基因调控的精确过程，其途径主
要有两条，一条是死亡受体通路，配体和受体结合形
成诱导凋亡的复合信号物而激活caspase；一条是线
粒体通路，释放凋亡酶激活因子激活caspase，两条通
路最后都汇聚于caspase-3活化这一点上。caspase-3
是caspases家族中最特征化的一个酶，被称谓凋亡
信号的主要执行者(centralexecutioner)。一旦活化，
caspase-3可以裂解许多涉及细胞结构、信号传导和
与DNA修复有关的蛋白，最终引起细胞凋亡【J7’81。
对于细胞周期、细胞凋亡既有联系又不完全一致，如
细胞凋亡的增多可能伴有细胞增殖的抑制即细胞周
期的改变，但二者改变程度并不一致。但H：O：引起
的细胞凋亡很可能有多个信号传导途径参与的过
程。正常细胞在遭遇损伤和应激等刺激后细胞周期
的正常进行被破坏一J。DNA片断化发生于细胞凋
亡的晚期，是细胞凋亡特有的现象¨引。
凋亡的细胞因DNA分裂成一些小片段漏出，使
DNA直方图上出现一个位于G．峰左侧的小峰，即凋
亡(apo)峰。G2／M期阻滞是凋亡的前提条件。从实
验结果中可以看出，本实验中损伤组的细胞G：期、S
期细胞比例降低，这表明进入增殖期细胞比例降低。
s期比例降低，其意味着DNA合成减少；G：期比例
降低说明细胞分裂减慢，进而说明了氧化损伤具有
抑制细胞DNA合成、细胞分裂和增殖的作用，因而
我们推断H：O：诱导的细胞凋亡可能发生于G-期，
如钙∞弘如笛加：。m，O
o_芒sI∞o五oci
o苗一专冒舀
万方数据
中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2008Nov；24(11)·1517·
而不是以前认为的G：／M期。本实验中，损伤组的
easpase-3在mRNA水平上表达最高，说明氧化损伤
也启动了经caspase-3的凋亡信号的转导，导致细胞
的凋亡甚至死亡，蚤休醇提物干预后表达下降，推测
应是阻抑细胞周期由G，期至S期的转化同时阻断
细胞凋亡相关蛋白的表达而发挥保护作用。两者之
间是否存在一定的关联，尚需进一步的研究证实。
中草药中含有丰富的自由基清除成分，本研究
对蚤休药理药效进行了研究，表明蚤休提取物具有
一定的抗氧化性。而机体的许多病理生理现象如衰
老、动脉粥样硬化、缺血／再灌注损伤都与自由基对
机体的氧化损伤有关，因此本实验首次发现了蚤休
醇提物的生物学效应，初步肯定此药物对内皮细胞
氧化损伤的保护作用，但是mRNA要经过转录和翻
译后才能表达有功能的蛋白，所以仍需在蛋白质水
平上对蚤休醇提物抑制血管内皮细胞凋亡的机制进
行探讨。
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(1．DeptofPathophysiology，TaishanMedicalCollege，TaianShandong271000，China；2．ShandongUniversityof
TraditionalChineseMedicine，Jinan250014，China；3．MedicalCollegeofShandongUniversity，Jinan250012，China)
Abstract：AimTomakeethanolfrombistortaeningresultshowedeadyandadvancedstageapoptosis
(EFB)fromtraditionalChinesemedicinebistortae，and
investigatetheprotectionontheinjuryofthehuman
umbiliarveinendothelialcell(ECV31M)inducedby
hydrogenperoxide(H202)．MethodsECV304cells
wereculturedanddividedbyfiveexperimentalgroups
includingnormal，injurymodelinducedbyH202and
threepretreatedgroupswithEFB；flowcytometry
(FCM)methodsAnnexinv／PIstainingandPIstai—
ningwereusedtoanalyzetlleeffectofthemedicineon
theapoptosisandcellcycle；reversetranscriptionPCR
(RT．PCR)wasusedtodetectthemRNAexpression
levelofapoptosisassociatedproteincaspase-3inallex—
periment—algroups．ResultsFCMAnnexinV／PIstai—
ratewaslowerwhenpredisposedthanthatofthedam-
agedgroup，FCMPIstainingshowedthereweremore
cellsinGo／Glstageinoxidationdamagegroup，but
lessinSstage，andhypodiploidpeakcouldbeob—
served，RT-PCRshowedthattheexpressionofeaspase一
3wasweakenedwhenpredisposedbyEFBthanwithout
thisdisposal(P<0．01)．ConclusionsEFBhasthe
protectiveactiononoxidativedamageofECV304in—
ducedbyH202，themechanismmayrelatetothepro-
tectionofnomalcellcycleandthedecreaseofthecell
signaltransductionofapoptosisviacaspase-3．
Keywords：endothelialcell；ethanolfrombistortae；ox．
idation；injury；cellcycle；apoptosis；easpase-3
万方数据
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