OneShineSybrGreenpreMixTaq目录I试剂盒原理II试剂盒简介III试剂盒内容IV保存和运输V操作方法V
IRealTimePCR体系配制VII试剂盒特长VIII注意事项IX引物设计策略X应用RocheLightCycle
rRealTimePCR扩增仪的操作方法XI实验条件的选择XII反应举例XIIIRealTimePCR检测基因表达量
实验成败的关键OneShineSybrGreenpreMixI试剂盒原理PCR是PolymeraseChainReac
tion（聚合酶链式反应）的缩写，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作在生物体外的特殊DNA复制。PCR技术的基
本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性。模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便
它与引物结合，为下轮反应作准备。②模板DNA与引物的退火(复性)。模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DN
A单链的互补序列配对结合。③引物的延伸。DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板
，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三个过程就可获得更多
的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
RealTimePCR与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。可以在PCR体系指数扩增
期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。由于Real
TimePCR扩增的片段长度通常为250bp以下，所以每完成一个循环需要不到1分钟的时间，1小时内就能将待扩目的基因扩增放大几
百万倍。RealTimePCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。OneShineSybrG
reenpreMix所含的SybrGreen荧光染料可以嵌合进DNA双螺旋小沟内，外界的激发光对DNA分子进行照射后会使DNA
分子产生发射光。在游离状态下，SybrGreen发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强，SybrGreen的荧光信
号强度与双链DNA的数量相关。当富集的DNA双螺旋高温变性后，双链打开，随即SybrGreen从小沟上脱落，荧光信号也随之降低。因
此，可以根据荧光信号的强度检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SybrGreen的最大吸收波长约为497nm，发射波波长最大约为
520nm。产生激发光的光学元件位于RealTimePCR仪中，同时检测DNA发射光的光学元件也位于RealTimePCR
仪中。RealTimePCR仪的硬件系统与安装有相应软件的计算机系统相连，通过计算机软件就可以选择激发光的波长和收集某种波长的
发射光。收集的发射光被计算机软件编制成实时动态的坐标轴形式的曲线，曲线的变化状况体现了发射光光源位置、光谱组成、光照强度随时间的变
化情况。II试剂盒简介OneShineSybrGreenpreMix是在完整的生产工艺条件下，通过严谨的创新态度、规范的创
客作风、精湛的技艺手法精制而成，具有与国内外一线品牌的相似试剂盒一决高下的品质，是公司生产、高校或研究机构科研、行政事业部门检验检
疫或个人兴趣爱好实践的优选品牌。OneShineSybrGreenpreMix含有与DNA双螺旋特异性结合的、耐高温的和极其灵
敏的SybrGreen，耐高温、特异地扩增的DNAPolymerase，用优级纯的无机或有机试剂调配出的pH缓冲剂、离子强度稳
定剂、氧化还原稳定剂、PCR体系干扰物质去除剂，合适的Mg2+浓度，进口的dNTPs，以及独家研发的温度变化稳定剂、ddH2O等，
使产品具有更强的稳定性、灵敏性、高效性、持久性等。产品是以2×conc.的形式配制的，在使用时需要加入自备的适当浓度的模板、引物和
ddH2O。OneShineSybrGreenpreMix可以用于检测各种生命来源的DNA、cDNA的初始含量、扩增系数、扩增
含量、DNA谱，如人、小鼠、白掌、蕈菌、大肠杆菌、艾滋病假病毒等。可以与国内外各种主流RealTimePCR仪无缝对接，比如T
hermalCyclerDiceRealTimeSystem、AppliedBiosystems7300/7500/
7500FastReal-TimePCRSystem、StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem
、LightCycler、SmartCyclerSystem/SmartCyclerIISystem、Eppendorf
AGMastercyclereprealplex2、BIO-RADCFX96等。III试剂盒组成项目数目2×One
ShineSybrGreenpreMixSybrGreen1ml/支×1000支TaqPolymeraseBufferdNT
PsMg2+专研温度变化稳定剂ddH2O1ml/支×1000支MgCl2100ul/支×1000支IV保存和运输储存时放置在-20
℃，经常使用时则放置在4℃。运输时模拟-20℃，可以采用干冰或冰袋包埋本产品。同时，还需要避光保存。V操作方法1、关闭直射光源，
避开窗口太阳光；准备好冰，打开包装，将所有产品放在冰上融化或维持低温。2、提前半小时打开RealTimePCR仪器。编辑好各处
理的温控程序、曲线要求、染料类型、反应板位置信息等。2、根据处理的种类和重复数计算出所需要2×OneShineSybrGreen
preMix的量，计算出各处理所需模板的量，计算出各处理所需引物的量，计算出各处理补齐所设定体系所需ddH2O的量。3、取灭过菌
的离心管插在离心管架上，插入冰中；排好即将使用的RealTimePCR仪所匹配的PCR八联管或96孔板，插入冰中。注意不要让冰
水进入管子内。4、调整好移液器，往每支离心管中吸入对应于各处理的2×OneShineSybrGreenpreMix的量。5、往
每支离心管中吸入对应于各处理的模板量和引物量。6、往每支离心管中吸入对应于各处理的ddH2O量，轻柔颠倒混匀。7、调整移液器到所设
定PCR体系的体积的读数，从各离心管中吸入相应体积的反应液到PCR八联管或96孔板中。在PCR八联管或96孔板的末端或边缘标记好处
理编码。8、盖上PCR管盖或覆上光学级封膜。注意不要让有粘性物粘在管盖或膜上。9、离心除去加样时PCR管内吹出的气泡。10、打开仪
器盖子或弹出托盘，把离心管小心按顺序放入仪器的模块或卡槽中。11、盖上仪器盖子或收入托盘。核对反应程序、各处理对应的反应板位置、染
料类型、反应体系。必要时编辑各反应孔的样品处理信息。12、点击开始运行。运行期间，将所剩的2×OneShineSybrGreen
preMix试剂、模板、引物等放回冰柜保存。调回移液器并架于移液器架上，收拾干净实验桌面和归位各耗材器具，如果不再用冰则需要把冰
倒入水槽中。13、观察仪器各程序是否运行正常，观感曲线走势。必要时增加循环数、增加步骤数、跳入下一步或停止运行等。注意在跳入下一步
时应避免在延伸过程中跳入，最好是在变性温度跳入。14、程序运行完成后，将运行结果保存在合适的路径下，分析扩增曲线、熔解曲线、标准曲
线等。计算目的DNA片段的最终含量、特异性、扩增系数和初始含量。15、取出样品，清理好实验桌面、电脑桌面；取走存储设备，关闭仪器。
VIRealTimePCR体系配制以25ul为例，成分含量终浓度2×OneShineSybrGreenpreMix12
.5ul1×模板xulpM-nM引物F1ul0.2-0.8uM/ml引物R1ul0.2-0.8uM/mlddH2O10
.5-xul1×反应程序的设定以Bio-RadCFXRealTimePCR仪两步法为例：基因表达量的检测-扩增曲线的生成
，95℃3min95℃10s60℃30s（此步骤末收集信号）40cycles。引物特异性检测-熔解曲线的生成，95℃
10s65℃-95℃，每半℃升一次温度，持续5s（此步骤末收集信号）。VII试剂盒特长1、适用于RealTimePCR
反应，可以快速、准确地对目的基因进行定量检测。2、在2×OneShineSybrGreenpreMix中，预先混有SybrGr
een，PCR体系配制时只需入模板、引物、ddH2O即可，操作方便快捷。3、含有更耐高温并持续稳定的DNAPolymerase，
可以维持更多的循环数，提供了选择循环数更大的空间。更大的Ct值选择范围就意味着可以支持微量目的基因检测，检测范围fM-nM。4、反
应的Buffer更适合，使反应的基线更水平，无荧光污染信号。使线性期更陡峭，避免了Ct值的无效浮动。使平台期更平直。也确保了引物与
模板能够更特异地结合。5、SybrGreen更耐高温更足量，确保只要扩增反应在进行，目的DNA双链在增加，就有线性强度的荧光产生。
6、dNTPs更足量，确保反应有更高的平台期荧光信号。7、Mg2+浓度更适合，确保线性期有爆发式的目的DNA片段合成，提高了线性期
反应体系的扩增系数和线性期的长度。8、更高的仪器适配性，SybrGreen染料可以被各大主流仪器的激发光所激发，产生明亮的荧光信号
，有利于仪器对信号的捕捉和处理。VIII注意事项1、本品长期保存需要在-20℃下。2、本品需要保存在避光条件下。若在室内光照超过1
2h，则应视产品为失效；经实测产品处于实验室日光灯下12h后则无法正常使用。3、配制PCR体系时需要在冰上和弱光环境中操作，最好关
闭实验室日光灯或打开非直射的日光灯。4、使用时请上下轻轻颠倒混匀，以避免成分不均影响实验结果，但是同时应避免气泡的产生。5、若短期
内多次使用，则可以将本产品放置在4度避光保存。避免反复冻融超过10次，经实测产品从-80℃至室温反复冻融10次以上则性能下滑。6、
本产品扩增片段的长度不宜超过250bp，因此应根据检测的特异性需要设计合适的引物对用于检测目的片段的表达量。反应循环数不宜超过70
cycles。7、请使用与所在实验室荧光实时定量PCR仪相匹配的RealTimePCR管或RealTimePCR板。体系
配好后应在适配的离心机中离心，除去管底加样时产生的气泡。8、避免用有荧光染料污染可能的器物表面接触PCR管的盖子或光学级封膜。9、
可以设计一对引物检测提取的RNA中是否有基因组的污染，设计时应保证至少有一端的引物设计在内含子区域；若无内含子，则可以将上游引物设
计在启动子区，经过PCR验证确保模板中无基因组的污染。10、曲线的转折点及线性期的陡峭程度与引物对模板的竞争性有关，引物越特异竞争
力越大，引物与模板结合所需要的时间越短，曲线转折点越紧急，曲线基线期、线性期和平台期越平直。11、反应体系的配制要迅速快捷。反应体
系配制好后不能在室温条件下长久地放置，以最大可能地避免非特异性扩增。可以在体系配制前，先将模板和引物混匀95℃预变性1min。如果
引物的Tm值较低，可以采用三步法扩增。12、DNA模板的添加量通常在100ng以下。因为不同种类的DNA模板中靶基因的拷贝数不尽相
同，所以必要时可以对模板进行梯度稀释，确定最近的模板添加量。另外两步法RT-PCR反应的cDNA添加体积不要超出总体积的10%，建
议PCR反应体积为25ul。13、本产品用于常规RealTimePCR检测体系的配制，若需要检测极端微量的cDNA或DNA，则
需要选用本公司的OneShineSybrGreenpreMixPlus试剂盒。14、应确保所在实验室仪器正常，并处于正确校准
后的运行之中。若需要校准RealTimePCR仪可联系仪器出产厂家，也可以联系本公司，本公司提供各种品牌实时荧光定量PCR仪的
校准方法、器材和试剂。IX引物设计的策略1、引物应于序列保守区内设计并具有良好的特异性，引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于7
0%或者有8个互补碱基同源。2、产物单链不能形成二级结构或双链不能形成其他互补结构（自由能小于58.61KJ/mol）。3、引物长
度一般在17-25碱基之间,上下游引物长度和Tm值不能相差太大。4、G+C含量在40%-60%之间，45-55%最佳。5、四种碱基
要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。特别是引物之间3′端不要有2个碱
基以上的互补配对。8、引物5′端可以被修饰。9、引物3′端不可被修饰，而且要避开AT、GCrich的区域，避开T/C、A/G连续
结构（2-3个）。引物3′端碱基最好为G或C。10、由于mRNA密码子的简并性，引物3′端要避开密码子的第3位。11、引物整体设计
自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo6软件进行比对看结果的情况。12、DNA单链的
长度最好是80-150bp，最长不多于300bp.13、为了避免DNA污染和可变剪接的影响，引物设计可以跨外显子。14、对于mRN
A最好位于编码区5’端的100-400bp区域内，可以用DNAman，Alignment等软件查看结果。15、查看有无假基因的存
在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。16、TM值在58-62度之间。Tm值技术的专业软件：OLIGO
1,63-68℃；Primer3，60-65℃。17、引物设计的软件Primer5.0有专门针对荧光定量PCR的，可以用软件
辅助设计。18、使用BLAST3检索引物的特异性。X应用RocheLightCyclerRealTimePCR扩增仪的操
作方法请按照LightCycler(RocheDiagnostics公司)的使用说明书进行实验操作。PCR反应用毛细管请用离心机
轻轻离心后放入LightCycler中进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得
不得良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法P
CR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照“实验条件的选择”一项。两步法PCR扩增标准程序：Stage1：预变性95℃
30s20℃/秒1CycleStage2：PCR反应95℃5s20℃/秒6
0℃20s20℃/秒40CycleStage3：熔解曲线分析95℃0s
20℃/秒60℃15s20℃/秒95℃0s0.1℃/秒XI实验条件的选择在选择实
验条件时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考量。要求配制能同时满足这两个条件的反应体系，并可以在较大浓度范围内进行很好的定量
。反应特异性高的实验体系应具备以下条件：1、NoTemplateControl时不产生引物二聚体等非特异性扩增。2、不产生目的
片段以外的扩增。扩增效率高的实验体系应具备以下条件：1、扩增产物起峰更早（Ct值小）2、PCR扩增效率高（接近理论值100%）Pr
imer浓度与反应性能间的关系如下：低浓度Primer（0.1uM）高浓度Prime
r（1.0uM）反应特异性：高低
扩增效率：低高PCR条件与反
应性能之间的关系如下：1、要提供反应特异性，可以提高退火温度或变为2StepPCR反应。2、要提高扩增效率，可以增加延伸时间或
变为3StepPCR反应。3、预变性条件通常设定为95℃30s，基本上可以将环状质粒DNA和基因组DNA模板很好地变性。如果
遇到某些确实难变性的模板，可以延长变性时间，比如95℃1-2min。XII反应举例以25ul反应体系，用本试剂盒定量检测了小
鼠肝脏RNA（Musmusculusbrain-derivedneurotrophicfactorBDNF2C(Bdn
f)mRNA）、白掌叶片RNA（SpathiphyllumkochiiisolateGPchloroplast）、蕈菌整
株RNA（Purpureocilliumlilacinumglyceraldehyde-3-phosphatedehydro
genasepartialmRNA）、TaqPolymeraseRNA（表达于BL21(DE3)中）等的基因表达情况。扩增
得到的曲线如下图所示：从图中可以看到，采用OneShineSybrGreenpreMix试剂盒配制的RealTimePCR
体系，在BIO-RADCFX仪上经过40个循环的扩增以后，目的基因的片段被极度扩增。采用我们公司生产的试剂盒，可以得到更小的Ct
值、更长的线性期、更高的平台期、曲线各期的转折更急促。同时我们也用市场上销售的知名公司的同价位的试剂盒做对比，可以发现OneShi
neSybrGreenpreMix有很多优势，如下图所示：Roc公司Tak公司本产品从图中可以看出，相同的模板、引物浓度，Ro
c公司的Ct值较大、线性期很短、平台期很低、各期之间转折点太平滑。Tak公司的Ct值较大、线性期较短、平台期较低、各期之间的转折较
平滑。而本公司的产品Ct值较小、平台期很高、各期之间转折很急促。一般说来平台期越小，线性期越短，各期转折越模糊，这势必会影响到Ct
值的准确性，外界因素对曲线的影响比较大；另外平台期较低的产品往往是为了节省成本才开发的，因为这种产品里面的dNTPs含量很低，dN
TPs的含量不足以支撑40个cycle的所需。我们还发现公司2的产品反复冻融次数极差，冻融超过3次基本上就无法用了，这是因为这种产
品里的DNAPolymerase耐温度变化性极差，其DNAPolymerase是一种截断的小分子量蛋白质；这种公司一味地追求低
成本，使RealTimePCR实验变成了一种应付走过场的实验。而OneShineSybrGreenpreMix里面dNTP
s的含量足，意味着检测的模板含量范围更大；里面的DNAPolymerase更稳定更耐温度变化，可以反复冻融10次以上，这意味着可
以进行更多的循环，支持检测微量cDNA；这款产品还有线性期更长更陡的特点，这使Ct值更能准确反映反应体系中实际的cDNA含量，反映
反应的Buffer更适合引物与模板的竞争性结合。XIIIRealTimePCR检测基因表达量实验成败的关键1、模板的准备。模
板准备成功与否主要取决于RNA的提取和反转录两个实验流程。RNA的提取是指用试剂盒试剂或自配试剂按照操作说明或基本操作流程所提取的
RNA能否反映所处理组织内真实的RNA浓度比例。我们经常用内参基因来相对定量目的基因，但是在提取RNA时不同的RNA序列降解的速率
是不一样的；不同的RNA的理化性质也是不一样的，这意味着相同的提取试剂对不同的RNA提取效率不一样；所以基于内参基因的相对定量法也
不是百无一失的。在提取RNA时，我们总希望既要得到更多的目的RNA，又要使RNA足够的纯，这往往是鱼和熊掌不可兼得的，所以就要有完
美的实验操控能力和误差预判能力，这在分析数据定性结论时具有非常重要的抽象逻辑意义，只有这样才能真实反映我们所处理的样品目的基因的表
达量是怎样改变的。另外反转录实验过程同样是影响实验结果准确度的重要一环，因为不同的RNA有不同的序列组成，特别是当用Oligo-d
T作为引物合成cDNA第一条链时，不同长度的polyA尾与Oligo-dT的结合效率是不一样的，这就能导致不同序列的RNA即使是相
同的提取浓度也不见得一定会得到相同浓度的cDNA第一条链。除了这些系统性的误差以外，很多操作上的偶然误差一样可以影响实验的准确度和
精确度。产生这些系统性误差的本质是不同的RNA有不同的序列和不同的理化性质。2、引物的合成。引物同样是涉及到DNA本身的序列以及序
列决定的不同的理化性质，但是相比较于处理条件下细胞内目的基因的表达变化这种自然过程引物的合成又是比较可以人为控制的一种实验因素，因
为合成引物毕竟是一项体外生化实验操作。引物与模板的匹配度、所要检测目的基因上某段片段的长度、引物的序列组成及碱基分布都会影响后续曲
线的形状。所扩增区域的选择甚至可以影响到SybrGreen与DNA双螺旋小沟的结合效率和稳定性。引物的特异性也是一个非常大影响因素
，它决定着你是否能在现有仪器精密度的条件下特异地检测你所预期的目的片段的荧光信号。因为RNA有可变剪接、同源基因协同表达等，引物的
特异性不仅仅是一项体外生化实验参与者，引物的特异性也体现了生命活动不为人知的处女地一面；只要细胞在行使生命活动那么细胞就在进化，那
么就有新的RNA出现或者原来的基因出现新的剪接模式。谁能阻挡住生命进化，哪怕是仅仅是让生命停止进化1s都是不可能的事。3、RealTimePCR仪器RealTimePCR仪器是一种精密的生化实验常规仪器，它诞生之初就是为了服务于生命科学研究的，特别是服务于转录组的研究。相对于染料法检测荧光信号，探针法更具有针对性和准确性，但探针在模板上的位置的选择也极度影响曲线的走势。我们发现，在高校的RealTimePCR仪器的管理上有一定的疏漏，有些仪器很少校准，有些即使校准了也没有娴熟的专业人员进行操作培训，甚至有些仪器已经有硬件方面的损坏也在仍然凑合使用，这极大影响了科研工作者的实验数据的准确性和权威性。另外，就是众多初学者对于如何编辑最适合于自己这次实验的反应程序容易走过场，认为反正就是那么回事，调用一下师兄师姐的程序就可以了，不就是跑个会拐弯的曲线吗，不就是得到一个Ct值、熔解峰、标准定量吗。这种态度是不可取的，你是在搞科研还是在混毕业证抑或是混职称？4、实验数据的分析我们在这里提醒相关科研人员，你所得到的所谓Ct值、引物特异性和RNA初始量可能并因此而定性的实验结论有很大可能与你的处理引起的变化完全相反，比如本来呈阴性的你这里却是足量表达。原因不是你数据分析本身，你的确掌握各种统计学技能，会用各种统计学软件，然而你一开始就把自己的实验问题置于了一个不正确的生物学假想上，你下定的实验结论已经不再是描述一个具有生物学意义的事件，而是描述了一个体外的生化反应事件。 |
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