实验22影响酶促反应因素——温度、pH和抑制剂1.实验目的（1）通过本实验了解pH、温度、抑制剂对酶活力的影响。（2）通过实验掌握控
制变量法，并能使用控制变量法设计实验。2.实验原理本实验通过对胰蛋白酶的测试，考察温度、pH、抑制剂对酶活性的影
响。（1）温度的影响：酶是生物体内一类具有催化活性的蛋白质，与一般催化剂一样存在温度效应。开始时，酶促反应的速率随温度的增
加而增加，达到最大反应速率时的温度为酶的最适温度，而超过最适温度，会引起蛋白质变性，使酶促反应速率降低直至停止。（2）
pH的影响：绝大多数酶在一定的pH范围内才有活性，酶活性最高的pH称为酶的最适pH，高于或低于最适pH都会使酶活性降低。酶的最适p
H并不是一个物理常数，对于同种的酶，其最适pH会因为缓冲溶液和底物的不同而存在差异。（3）抑制剂的影响：抑制剂对酶活性的
影响分为可逆型和不可逆型，可逆型抑制剂和底物的关系可分为：竞争型抑制、非竞争型抑制、反竞争型抑制剂。（例如本实验中采用的胰蛋白酶抑
制剂苯甲脒的抑制方式为竞争抑制）3.实验试剂和器材（1）试剂的配制·5%三氯乙酸溶液·1mmol/L苯甲脒溶液：取
19.25g苯甲脒溶液，用水溶解，再定容至100mL。·1%酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液10mL
，水40mL，置于60oC水浴中加热至溶解，冷却至室温，加水稀释至100mL，并调pH为8.0。·0.1mol/L硼酸溶液：
A液：0.1mol/L硼酸溶液：称取6.18g硼酸，溶于1000mL水中B液：0.025mol/L硼砂溶液：称取9.54g硼砂
（Na2B4O7·10H2O）溶于1000mL水中。使用A液和B液配制如下pH的缓冲溶液：胰蛋白酶溶液：可使用粗提的猪胰蛋白酶
。溶液浓度为50-200μg/L，用0.1mol/L、pH8.0的硼酸缓冲溶液配制。（2）器材：·试
管若干·移液管若干·100mL的量筒·恒温水浴
·冰浴·白瓷板·胶头滴管
·分光光度计4.实验步骤将实验分成三组进行，分别是温度组、pH组和抑制剂组。（1）温度组：首先设置空
白组：在试管中加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯乙酸溶液，摇匀后在加入0.2mL酶液，在37oC条件下恒温反应10m
in。对温度的测试：取3支试管，依次编号为1、2、3，向三只试管中各加入0.2mL的胰蛋白酶溶液和0.8mL的蒸馏水
，再分别在0oC、37oC、70oC的条件下预处理5min，然后向三支试管中分别加入1.0mL酪蛋白溶液，混匀后至于相应的温度下恒
温反应10min，之后向三支试管中各加入3.0mL5%三氯乙酸溶液以停止反应。将以上试管以3000r/min离心5min，取上清液
在280nm波长测定吸光度。（2）pH组设置空白组：取一支试管，加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三氯乙酸
溶液，摇匀后加入0.2mL酶液和0.8mL蒸馏水，在37oC下恒温10min。对pH的测试：取3支试管，依次编号1、2
、3，向3支试管中分别加入0.2mL胰蛋白酶溶液，向1号试管中加入0.8mLpH=7.4的硼酸缓冲液，向2号试管中加入0.8mLp
H=8.0的硼酸缓冲液，向3号试管中加入0.8mLpH=9.0的硼酸缓冲液，上述试管置于37oC水浴中恒温2min，然后加入各加入
1.0mL1%酪蛋白溶液，在37oC水浴中继续恒温10min后加入三氯乙酸切断反应。将上述试管以3000r/min离心5min，取
上清液在280nm波长测定吸光度。（3）抑制剂组设置空白组：取一支试管，加入1.0mL1%酪蛋白溶液和3.0mL5%三
氯乙酸溶液，摇匀后加入0.2mL酶液和0.8mL蒸馏水，在37oC下恒温10min。对抑制剂作用的测试：取两支
试管，编号1、2，在两支试管中分别加1.0mL1%酪蛋白溶液，然后在1号试管中加入0.8mL蒸馏水，在2号试管中加入0.1mL1m
mol/mL苯甲脒溶液和0.7mL蒸馏水，在37oC水浴中恒温2min，然后向两支试管中各加入0.2mL的胰蛋白酶溶液，在37oC
水浴中继续恒温反应10min，最后加入三氯乙酸终止反应。将上述试管以3000r/min离心5min，取上清液在280nm波长测吸光
度。5.注意事项在实验中，要特别注意防止交叉污染，要做到滴管、移液管专管专用，不能混用，以免造成试剂的交叉污
染，造成实验结果不可靠。实验试管组内、组间编号要清晰，防止造成实验结果混乱6.思考及总结（1）酶促反应速率最大时，
对应温度和pH成为最适温度和最适pH（2）在温度较低时，酶活性随着温度的升高而提高，酶促反应速度增大，达到最适温度时，反应速率最
大，超过最适温度，酶就会失活，导致反应速率降低甚至停止。绝大多数酶的必须在一定的pH范围内才有活性，过高或过低都会抑制酶的活性，导
致酶促反应速率降低。抑制剂可以通过破坏酶的分子结构或者与底物竞争结合位点来抑制酶活性，本实验中苯甲脒就是通过与底物竞争结合位点来抑
制酶的活性，影响反应速率。（3）传统催化剂常在高温、高压等极端条件下工作，而由实验数据可知，酶必须在温和的条件下工作。酶的催化效率较高，但是必须在温和但很苛刻的条件下工作，这是酶与传统催化剂的一个显著差别。B液A液pH80mL20mL9.030mL70mL8.010mL90mL7.4 |
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