2009年第67卷
化学学报
Vol.67,2009
第9期,974～982ACTACHIMICASINICANo.9,974～982
E-mail:zenghp@scnu.edu.cn
ReceivedNovember20,2008;revisedDecember26,2008;acceptedJanuary5,2009.
国家自然科学基金(No.20671036)和广东省科技项目(Nos.2007A010500008,2008B010800030)资助项目.
·研究论文·
(E)-N-芳基-3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]咔唑的合成、抗氧化活性及促
进鼠骨髓间质干细胞增殖的研究
王光荣
a
李熙灿
b
曾和平
,a
(
a
华南理工大学化学科学学院功能分子研究所广州510641)
(
b
广州中医药大学广州510405)
摘要设计合成了3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲苯基咔唑(8)和3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲氧苯基咔唑
(9)两个新的化合物,用IR,MS,
1
HNMR和元素分析确认其结构.并利用DPPH?方法,超氧阴离子自由基(
2
O
?－
)法,羟
基自由基HO?法和噻唑蓝比色法(MTT法)分别测定了目标产物的抗氧化活性和调控鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的作用.
结果表明,这两种化合物对DPPH?自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基具有较强的抗氧化活性,化合物9在低浓
度时对鼠骨髓间质干细胞增殖有很好的促进作用.
关键词3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲苯基咔唑;3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲氧苯基咔唑;抗氧化活性;
骨髓间质干细胞
Synthesis,AntioxidationActivityof(E)-9-p-Tolyl-3-[2-(8-hydroxy-qui-
nol-2-yl)vinyl]-carbazoleand(E)-9-(p-Anisyl)-3-[2-(8-hydroxy-qui-
nol-2-yl)vinyl]-carbazoleandTheirInductionProliferationof
MesenchymalStemCells
Wang,Guangrong
a
Li,Xican
b
Zeng,Heping
,a
(
a
InstituteofFunctionalMolecule,SchoolofChemistry,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou510641)
(
b
GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510405)
Abstract(E)-9-p-Tolyl-3-[2-(8-hydroxyquinol-2-yl)vinyl]-carbazole(8)and(E)-9-(p-anisyl)-3-[2-(8-hy-
droxyquinol-2-yl)vinyl]-carbazole(9)havebeensynthesizedandconfirmedbyUV-Vis,FT-IR,MS,
1
HNMRandelementalanalysis.Meanwhile,theantioxidationactivityandstemcellactivityofthetitle
compoundshavebeeninvestigatedbytheDPPH?,
2
O
?－
,HO?andMTTmethods,showingthatthetitle
compoundshavestrongantioxidationactivity,andcompound9caninduceeffectivelytheproliferationof
mesenchymalstemcellsunderalowconcentrationcondition.
Keywords(E)-9-p-tolyl-3-[2-(8-hydroxyquinol-2-yl)vinyl]-carbazole;(E)-9-(p-anisyl)-3-[2-(8-hydroxy-
quinol-2-yl)vinyl]-carbazole;antioxidationactivity;proliferationofmesenchymalstemcell
咔唑衍生物被广泛用作有机小分子和聚合物发光
材料而倍受人们关注
[1～7]
.此外,咔唑及其衍生物作为
重要的精细化学品中间体,在医药、农药、染料、香料、
高分子等领域有广泛的应用
[8]
.8-羟基喹啉及其衍生物
No.9王光荣等：(E)-N-芳基-3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]咔唑的合成……975
大都具有生物活性,是常用的消炎灭菌、抗肿瘤药物
[9]
、
抗结核病试剂
[10～11]
、抗HIV-1试剂
[12]
、抗疟疾试剂
[13]
等,其在消除自由基和防止脂质过度氧化方面也有特殊
功效
[14]
.7-甲酰基-8-羟基喹啉是合成抗癌药物的重要中
间体
[15]
.
自由基是生命体活动时所产生的一类活性分子,可
被抗氧化剂或起抗氧化作用的酶中和
[16]
.在正常代谢
过程中,肌体内的自由基的生成和清除处于动态平衡状
态中
[17]
.但当人体出现各种负荷状态时,自由基的形成
和消除之间的动态平衡就会丧失,从而攻击细胞组织,
引发各种疾病.大量研究表明,炎症、肿瘤、衰老、血
液病以及心、肝、肺、皮肤等各方面疑难疾病的发生机
理与体内一些自由基产生过多或清除自由基能力下降
有着密切的关系
[18,19]
.因此,用于清除自由基防止脂质
过度氧化的抗氧化剂的研究已得到普遍关注.
由于骨髓间质干细胞具有多向分化、高度增殖及自
我更新能力,在一定的条件下可以向软骨细胞、成骨细
胞、肌腱细胞、脂肪细胞、肌管以及神经细胞等分
化
[20～23]
,在组织工程、基因治疗和细胞治疗中有着广阔
的应用前景.因此,寻找调控MSCs增殖的物质成为近
年来干细胞领域的研究热点.本研究小组最近发现,2-
乙烯基-8-羟基喹啉在促进骨髓间质干细胞增殖作用显
著
[24]
,5-[2-(8-羟基喹啉-2-基)乙烯基]-2-甲基-8-羟基喹
啉有较强的抗氧化活性,在低浓度时对鼠骨髓间质干细
胞有促进作用
[25,26]
.为此,我们设计合成了两个新型的
N-芳基取代的喹啉基咔唑衍生物,其中的化合物合成及
抗氧化活性和调控鼠骨髓间质干细胞增殖作用未见文
献报道.其合成见图式1.
1实验部分
1.1仪器与试剂
细胞培养及免疫组化试剂:低糖L-DMEM,Percoll
和胎牛血清(FBS)为GIBCOL公司产品,抗体免抗
CD34,CD44,CD45,PCNA,CD54,生物素化二抗(羊抗
兔),SABC,DAB染色试剂盒增色购于武汉博士公司.
噻唑蓝比色法(MTT),5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)及其单克隆
小鼠抗体为SIGMA公司产品;清洁级Sprague-Dawley
大鼠由广州中医药大学实验室动物中心提供.UV采用
HITACHIU3010紫外光谱仪;IR采用BRUKETensor27
红外光谱仪(KBr压片法);熔点测定采用X-4数显显微
镜熔点测定仪;
1
HNMR采用DRX-400MHz核磁共振
仪,TMS为内标,CDCl
3
为溶剂;MS(ESI)采用DECAXP
MAXLCQ型质谱仪;元素分析采用Perkin-Elmer2400
元素分析仪;BrukerSmartAPEXII衍射仪.2-甲基-8-羟
图式1化合物8和9的合成
Scheme1Synthesisofcompound8and9
基喹啉购于东京化成试剂公司,二苯代苦味酰基自由基
(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH?)为化学纯,日本
东京化成工业株式会社;其它所有试剂均为市售分析纯
(使用前未纯化).柱层析硅胶使用青岛海洋化工厂的产
品(100～200目).
1.2N-对甲苯基咔唑(4)的制备
化合物4参照文献
[26]
合成.称取1.01g(6mmol)咔
唑1,1.31g(6mmol)4-碘甲苯2、0.11g(0.6mmol)活化
铜粉、10mL二甲苯、0.03g(0.6mmol)氢氧化钾、0.11
g(0.6mmol)邻菲咯啉放入反应容器,接上干燥管,在氮
976化学学报Vol.67,2009
气的保护下,控制反应温度为145℃,磁力搅拌,反应
48h,趁热过滤,滤液真空蒸发得浸膏,层析柱进行分
离,石油醚和乙酸乙酯梯度洗脱,用石油醚结晶得无色
柱状晶体1.17g,产率76%,m.p.104℃.
1.3N-对甲氧苯基咔唑(5)的制备
化合物N-对甲氧苯基咔唑(5)与化合物4的合成方
法相同,化合物3用量是1.41g(6mmol),柱分离得无
色柱状晶体1.26g,产率77%,m.p.155～156℃.
1.43-甲酰基-N-对甲苯基咔唑(6)的制备
化合物6参照文献
[27]
合成.在氮气的保护下,在冰
水浴中,将2.4mLPOCl
3
逐滴加入到装有10mLDMF
三口烧瓶中,搅拌,滴加完毕,升温至20～30℃,边搅
拌边加入溶解在10mL1,2-二氯乙烷的1.14g(4.4
mmol)化合物4,在85℃下搅拌24h后,反应完毕后将
反应混合物倾入40mL冰水中,用二氯甲烷萃取三次,
有机层用饱和NaCl水溶液洗涤,用无水硫酸镁干燥后
减压除去溶剂,残留物用硅胶色谱柱分离纯化,以二氯
甲烷和石油醚混合液梯度洗脱,得到淡黄色的固体,然
后用乙酸乙酯重结晶得无色柱状晶体1.02g,产率81%,
m.p.145～146℃.
1.53-甲酰基-N-对甲氧苯基咔唑(7)的制备
3-甲酰基-N-对甲氧苯基咔唑(7)与化合物6合成方
法相同,化合物5的用量是1.21g(4.4mmol),柱层析分
离,用乙酸乙酯结晶得黄色的块状晶体1.1g,产率
82.5%,m.p.133～134℃.
1.62-(8-羟基喹啉基)乙烯基-9-N-对甲苯基咔唑(8)的
合成
化合物8参照文献
[28]
合成.称取0.56g(3.5mmol)
2-甲基-8-羟基喹啉和1.01g(3.5mmol)N-甲苯基咔唑-3-
醛溶于15mL的乙酸酐中,搅拌,使化合物完全溶解,
接上干燥管,充氮气保护,加热升至反应物沸腾(130
℃),回流反应48h.反应结束后冷却至室温,将反应混
合物倾入50mL的冰水中,搅拌3h,二氯甲烷萃取三
次,溶剂减压除去,得到的黑色沉淀,用柱层析分离,
石油醚和乙酸乙酯混合溶剂梯度洗脱,得黄色粉末状固
体0.94g,产率62.5%.m.p.149～150℃,UV-vis
(DMF)λ
max
:379,305nm;
1
HNMR(CDCl
3
,400MHz)δ:
2.37(s,3H,CH
3
),7.04(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.10～
7.16(m,2H,ArH),7.20(d,J＝8.0Hz,2H,ArH),7.24(d,
J＝7.4Hz,1H,ArH),7.26～7.34(m,2H,ArH),7.41(d,J
＝16.0Hz,vinylicH),7.44～7.48(m,2H,ArH),7.51(d,J
＝7.8Hz,2H,ArH),7.54(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.56～
7.61(m,2H,ArH),7.72(d,J＝16.0Hz,vinylicH),7.87
(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),9.18(s,1H,OH);IR(KBr)ν:
3389,3029,2954,1645,1593～1507,1335cm
－1
;
MS(ESI)m/z:427(M＋H)
＋
.Anal.calcdforC
30
H
22
N
2
O:C
84.48,H5.20,N6.57;foundC84.61,H5.22,N6.55.
1.72-(8-羟基喹啉基)乙烯基-9-N-对甲氧苯基咔唑(9)
的合成
2-(8-羟基喹啉基)乙烯基-9-N-对甲氧苯咔唑(9)与化
合物8的合成方法相同,其中化合物7的用量是1.54g
(3.5mmol),柱分离得黄色粉末状固体0.96g,产率
61.2%,m.p.147～148℃,UV-vis(DMF)λ
max
:379,305
nm;
1
HNMR(CDCl
3
,400MHz)δ:3.82(s,3H,CH
3
),6.90
(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.02(d,J＝7.6Hz,1H,ArH),
7.08～7.14(m,2H,ArH),7.22(d,J＝7.4Hz,1H,ArH),
7.25～7.33(m,2H,ArH),7.40(d,J＝16.0Hz,vinylicH)
7.42～7.47(m,2H,ArH),7.50(d,J＝7.8Hz,2H,ArH),
7.56(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.58～7.62(m,2H,ArH),
7.72(d,J＝16.0Hz,vinylicH),7.86(d,J＝8.0Hz,1H,
ArH),9.16(s,1H,OH);IR(KBr)ν:3386,3030,2951,
1624,1589～1510,1334,1240cm
－1
;MS(ESI)m/z:443
(M＋H)
＋
.Anal.calcdforC
30
H
22
N
2
O
2
:C81.43,H5.01,N
6.33;foundC81.52,H5.03,N6.31.
1.8化合物晶体结构测定
化合物4,5,6和7是已报道的化合物,但它们的晶
体结构还未见报到,对于化合物4,5,6和7晶体的X射
线数据是在室温下,由BrukerSmartAPEXII衍射仪收
集,数据处理使用SAINT＋程序包
[29]
,对于非氢原子采
用各向异性热参数,对于氢原子采用各向同性热参数.
得4,5,6和7的晶体结构如图1,结晶结构数据如表1.
1.9化合物8和化合物9体外抗氧化作用
1.9.1对DPPH?自由基清除率的测定
将化合物8和化合物9分别用DMSO溶解(不用
95%乙醇溶解,因在其中溶解性较差),各配成10mg/6
mL的浓度,置于冰箱中.准确称取DPPH?1mg溶于
24mLDMSO溶剂中,超声振荡5min,充分振摇,避光
保存(0～4℃).取DPPH?溶液1.0mL,加入不同量的
样品液(体积X＝30μL,60μL,90μL,150μL,240μL,
480μL),再补加(500－X)μL的DMSO溶剂,使混合液
总体积1.5mL.充分混合,在室温下静置30min后,以
原溶剂为空白调零,用微量比色皿在517nm处测吸光
度值(A
i
).按照上述操作,每个样品的每个浓度平行测
定3次,取平均值.同时用同法测DPPH?溶液与0.01
mLDMSO溶剂混合后的吸光度(A
c
),以及0.01mL样品
溶液与2mLDMSO溶剂混合后的吸光度(A
j
).为了对比
化合物8和9的实验结果,把常用的对照物谷胱甘肽
GSSG和还原型谷胱甘肽GSH作阳性对照组.样品对
No.9王光荣等：(E)-N-芳基-3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]咔唑的合成……977
图1化合物4,5,6和7的晶体结构
Figure1Crystalstructureofcompound4,5,6and7
DPPH?自由基的清除率P依下式计算:
清除率(%)＝[1－(A
i
－A
j
)/A
c
]×100%
其中A
i
为样品对DPPH?作用后的吸光度值;A
c
为未
加样品时DPPH?自身的吸光度值;A
j
为未加DPPH?时,
反应样品自身的吸光度值.
1.9.2在邻苯三酚自氧化体系中的抗氧化效果的测定
将化合物8和化合物9用DMF溶解(不用95%乙醇
溶解,因在其中溶解性较差),配成1mg/0.6mL的浓度.
取XμL(X＝0,2,5,10,20,30,40)样品液,加入到(1475
－X)μLTris-HCl缓冲液中(0.05mol/L,pH＝8.2,含1
mmol/LEDTA),若有细微颗粒,过微孔滤膜,再加25
μL连苯三酚溶液,迅速混合,开始计时.从60s开始,
此后,每隔30s读数一次吸光度值(325nm),到300s为
止.以Tris-HCl缓冲液为空白调零.0μL样品液为阳性
对照组.为了对比化合物8和9的实验结果,把对照物
GSSG和GSH作阳性对照组.设6个浓度,每个浓度测
3个平行样,取平均值.样品对
2
O
?－
自由基的抑制率按
如下公式计算:
(%)100%
AA
tt
P
A
t
??
??????
??????
????
??
???
??
?
??
对照
对照
－
抑制率＝
×
1.9.3对羟基自由基(OH?)的清除作用的测定
将化合物8和化合物9用DMF溶解(不用95%乙醇
溶解,因在其中溶解性较差),配成1mg/0.6mL的浓度.
在洁净干燥的试管中依次加入0.49mL的KH
2
PO
4
-
KOH缓冲液(0.2mol/L,pH＝7.4),0.01mL一定浓度的
样品液,0.1mL浓度为1.0mmol/L的Na
2
EDTA溶液,
0.1mL浓度为1.0mmol/L的FeCl
3
溶液,0.2mL12.0
mmol/L的H
2
O
2
溶液,0.2mL浓度为20.0mmol/L的脱
氧核糖溶液,0.1mL浓度为1.0mmol/L的Vc,保证每管
最终体积为1.2mL,于50℃下水浴20min,取出,冷
却.再加0.1mLTCA溶液(5g/100mL),0.1mL浓度为
1%的TBA溶液(W/V,内含100mmol/LNaOH),于沸水
浴上煮沸15min显色.(若有混浊,加入3mL正丁醇萃
取),在530nm处测吸光度值.以KH
2
PO
4
-KOH缓冲液
为空白调零.叔丁基羟茴香醚(BHA)为阳性对照组.设
6个浓度,每个浓度测3个平行样,取其平均值.
按以下公式计算样品的抑制率:
抑制率(%)＝(A
0
－A)/A
0
×100%
其中A
0
——0mL样品液时所测吸光度值,A——
0.01mL样品液时所测吸光度.
1.10化合物8和化合物9对MSCs的增殖活性
1.10.1MSCs的分离、体外扩增及鉴定
将大鼠股骨、胫骨骨髓用达式修正伊式培养基(low
glucoseDulbecco''smodifiedEagle''smedium,L-DMEM)
冲出,充分混匀,转入离心管,300g离心分离10min,
去除上层清液,再加入L-DMEM重新出现悬浊液.离心
分离去除上层清液后,再加入L-DMEM4mL混匀.
Percoll贮存液与0.1mol/L的磷酸缓冲液(PBS,pH＝
7.4)按体积比0.56∶0.44混合,密度为1.073g/mL.取4
mL放入10mL离心管内,吸骨髓液在离液面2cm处贴
管壁缓缓加入,水平离心机900g离心30min,收集单
核细胞层,用L-DMEM洗涤2次.然后计算细胞数,调
整密度,按1×10
6
/cm
2
密度接种,在37℃,体积分数为
5%饱和湿度的CO
2
孵箱中培养,培养液为含10%FBS
的L-DMEM,5d后更换培养液,弃去未贴壁细胞,3～4
d更换培养液1次,接近融合的MSCs用含0.25%的胰
酶室温消化2～3min,按1×10
4
/cm
2
传代,传至第3代
调整细胞浓度为1×10
7
/cm
2
时,将部分MSCs接种至含
盖片的24孔培养板内,滴加含10%胎牛血清(fetalbo-
vineserum,FBS)的DMEM培养液,2h后细胞处于贴壁
978化学学报Vol.67,2009
表１化合物4,5,6和7的晶体结构数据
Table1Crystallographicdataforcompound4,5,6and7
Compound4567
MolecularformulaC
19
H
15
NC
19
H
15
NOC
20
H
15
NOC
20
H
15
NO
2
Molecularweight257.32285.33273.32301.33
ColorandhabitColorlessrodColorlessrodColorlessrodYellowblock
Temperature/K298(2)298(2)298(2)298(2)
Wavelength/nm0.0710730.0710730.0710730.071073
CrystalsystemMonoclinicMonoclinicOrthorhombicMonoclinic
SpacegroupP2(1)/cPbcaPnP2(1)/n
a/?8.486(2)8.3346(2)16.2650(8)8.8891(2)
b/?21.053(6)13.7502(3)7.8175(4)13.4861(3)
c/?8.486(2)13.7397(3)22.8040(10)13.4779(4)
α/(o)90909090
β/(o)107.38107.24190107.831
γ/(o)90909090
V/?
3
1447.0(6)1503.85(6)2899.6(2)1538.11(7)
Z4484
ρ/(Mg?m
－3
)1.1811.261.2521.301
μ/mm
－1
0.0680.0780.0770.084
F(000)5446001152632
Crystalsize/mm0.28×0.25×0.210.16×0.13×0.100.12×0.10×0.080.20×0.18×0.14
θrangefordatacollection2.51oto25.24o2.15oto25.24o1.79oto27.55o2.19oto27.58o
h/k/l(max,min)
－10,10/－23,23/－10,
10
－8,10/－16,16/－16,16
－21,20/－10,10/－29,
29
－11,10/－17,13/
－17,16
Reflectionscollected116008922333217490
Independentreflections2589[R(int)＝0.0625]2729[R(int)＝0.0445]3324[R(int)＝0.0882]3543[R(int)＝0.0310]
AbsorptioncorrectionNoneNoneNoneNone
Refinementmethod
Full-matrixleast-
squaresonF
2
Full-matrixleast-
squaresonF
2
Full-matrixleast-
squaresonF
2
Full-matrixleast-
squaresonF
2
Data/restraints/parameters2589/0/1832729/2/4003324/0/1923543/0/210
Goodness-of-fitonF
2
1.1741.0250.991.034
FinalR
1
a
,wR
2
b
indices
[I＞2σ(I)]
0.0560,0.17630.0429,0.10540.0521,0.12410.0465,0.1078
R
1
a
,wR
2
b
indices(alldata)0.0790,0.21510.0829,0.12900.1317,0.15570.0835,0.1247
Largestdifferencepeak
andhole(e?nm
－3
)
0.194and－2460.207and－1160.129and－1470.146and－130
a
R=∑(F
o
－F
c
)/∑(F
o
).
b
wR=[∑w(F
o
2
－F
c
2
)
2
/∑w(F
o
2
)
2
]
1/2
.
未分化状态,取出盖片做Brdu,CD44免疫组化及两者
结合的免疫组化双重染色.
1.10.2MSC的分组培养
传至第三代的MSCs分为对照组和喹啉衍生物组.
对照组为L-DMEM培养液,喹啉b衍生物组为L-DMEM
培养液再加入8-羟基喹啉衍生物,称取适量的浓度溶于
二甲基亚砜中,配成浓度分别为1,5,10,15μg/μL.各组
分分别在96孔培养板中培养3d后做MTT法
[26]
.
2结果与讨论
2.1波谱性质
化合物8和9的红外光谱,在3400cm
－1
区域出现
了O—H键的伸缩振动吸收峰,在1645～1590cm
－1
区
域出现新形成的C＝C振动吸收峰,1600～1500cm
－1
区
域为芳环的振动吸收,在指纹区域850～450cm
－1
为苯
环氢的面外弯曲振动吸收.由质谱MS(ESI)m/z的数据
可知,化合物8和9(M＋H)
＋
峰分别在427,443处.由
1
HNMR数据可知,化合物8和9均有三组氢,δ2.37
(3H),3.82(3H)都分别为8和9上的甲基质子峰.碳碳双
键上的氢由于受到大的共轭效应,使之化学位移向低场
No.9王光荣等：(E)-N-芳基-3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]咔唑的合成……979
移到δ＞7处,因此芳环上的氢和碳碳双键(C＝C)上的
氢的质子峰处于同一组位移,化合物8在δ7.41和7.72
处两个氢的偶合常数、化合物9在δ7.40和7.72处两个
氢的偶合常数均为J＝16Hz,由此可知化合物8和9中
双键构型为反式.δ9.18,9.16分别为8和9上的羟基质
子峰.
2.2化合物8和化合物9体外抗氧化作用
2.2.1对DPPH?自由基清除效果
DPPH?在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其孤对
电子在517nm处有最大吸收峰(显深紫色).DPPH?溶液
中加入自由基清除剂时,孤对电子被配对,517nm处的
吸收消失或减弱,溶液颜色变浅,而吸光度变小的程度
与自由基被清除的程度成化学计量关系,通过测定吸收
减弱程度,可用来检测自由基的清除情况,从而评价某
物质的抗氧化能力
[30]
.因此,用清除率(%)来表示,清除
率越大,抗氧化能力越强.据此可以推测,凡是可以与
自由基进行反应,使自由基形成稳定状态的成分都有可
能起到清除DPPH?自由基的作用.结果见表2和图2.
从表2和图2中可以看出,化合物8对DPPH?自由
基具有较强的清除作用,并且随着化合物8DMSO溶液
用量的增加自由基的清除率逐渐增强,当用量为480μL
时,对DPPH?自由基的清除率达到最高点77.9%;化合
物9DMSO溶液对自由基的清除率也有同样的趋势,但
化合物9的自由基的清除能力相对来说较低,这两个化
合物都比对照物谷胱甘肽GSSG的自由基清除能力都强
很多,而比对照物还原型谷胱甘肽GSH的自由基清除
能力弱.化合物8和9分子结构只差一个氧原子,自由
基清除能力有较大的差别,产生这样差别的原因还有待
进一步研究.
2.2.2在邻苯三酚自氧化体系中的抗氧化效果
邻苯三酚在弱碱条件下(pH＝8.2)能迅速氧化,不
断反应生成超氧阴离子自由基(
2
O
?－
)和有色中间产物,
该有色物在325nm波长处有一特征吸收峰,吸光度值
在反应开始后一段时间之内随时间变化而线性增大.当
有自由基清除剂存在时,可以清除
2
O
?－
,从而阻止中间
产物的积累,使邻苯三酚自氧化产物在λ＝325nm处吸
收峰值减小.故通过测定A325值可以定量判断自氧化
反应的程度及计算出清除剂的清除率.室温下测定不同
质量浓度的化合物8和9对邻苯三酚自氧化体系的影响,
结果见表3.
如图3所示,化合物8和9对邻苯三酚自氧化体系
产生的
2
O
?－
有一定的清除作用,且随加入量的增加,清
除率上升,量效关系明显.当化合物8和9质量浓度到
44.4μg/mL时,两者的清除率都超过90%.比GSH清除
率高出10%以上.另一对照组的清除率仅为16%左右.
用EC50表示清除率为50%时的样品浓度,可知化合物8
和9的EC50分别为23.4μg/mL,17.8μg/mL.同时测得
GSH的EC50为16μg/mL.该实验结果表明化合物8对
2
O
?－
的清除作用与GSH相当.
2.2.3对羟基自由基?OH的清除效果
本文采用脱氧核糖分析法,利用Fe
3＋
-EDTA-抗坏
血酸-过氧化氢体系产生?OH.此方法中,脱氧核糖作
为?OH的攻击靶.脱氧核糖受?OH攻击后裂解,在酸
性、加热的条件下可以与硫代巴比妥酸反应生成红色化
合物.该红色化合物在530nm波长处有一强烈吸收峰.
故通过测定A530值可以定量判断有色化合物的生成量,
并可以计算出清除剂的清除率.叔丁基羟茴香醚(BHA)
是一种食品级的抗氧化剂,可以用于食品、化妆品、医
药、技术产品及塑料制品(PVC)等行业.室温下测定相同
质量浓度的化合物8,9和BHA对羟基自由基?OH的影
响.结果见表4.
由图4可知,化合物8和化合物9具有显著的清除
羟基自由基的能力.在浓度为0.833μg/mL时,化合物8
和9对羟基自由基?OH的清除率分别为78.2%和76.0%,
而相同条件下BHA的清除率52.5%.化合物8和9比
BHA的清除效果高出45%以上,化合物8和9清除羟基
自由基的能力方面值得进一步的深入研究.
表2化合物8和9对DPPH?自由基清除率
Table2Scavengingeffectofextractofcompound8and9onDPPH?radicals
各样品对DPPH?自由基清除率数据表
样品体积/μL样品浓度/(μg?mL
－1
)8清除率平均值8SD9清除率平均值9SDGSH清除率平均值GSSG清除率平均值
3033.3331.890.022822.7640.008127.50711.01
6066.6741.7680.004529.5930.001432.29414.853
9010046.8960.013434.8860.009547.72216.553
150166.755.7650.013138.0370.008658.51419.671
240266.766.5560.011743.5710.001975.15125.572
480533.377.8510.013350.3080.012595.01732.463
980化学学报Vol.67,2009
表3化合物8,9,GSSG及GSH清除超氧阴离子自由基数据P(%)
Table3Scavengingeffectofextractofcompound8and9on
2
O
?－
radicals
用量/μL
浓度
(μg/mL)
8平均P/%Mean±SD9平均P/%Mean±SD
GSH平
均P/%
Mean±SD
GSSG平
均P/%
Mean±SD
对照组0————————
22.2222220.1400970.140±0.0060.33212560.332±0.002570.304350.304±0.03160.143720.144±0.005
55.5555560.1727050.173±0.0210.361111110.361±0.008370.288650.289±0.02910.166670.167±0.010
1011.111110.2560390.256±0.0200.420289860.420±0.006280.400970.401±0.07260.136470.136±0.056
2022.222220.4782610.478±0.0290.548309180.548±0.03130.637680.638±0.2180.172710.173±0.0128
3033.333330.7198070.720±0.0060.759661840.760±0.01380.657000.657±0.07470.149760.150±0.029
4044.444440.9070050.907±0.0080.910628020.911±0.007550.795890.796±0.01830.163040.163±0.050
图2化合物8和9对DPPH?自由基清除效果
Figure2Scavengingeffectofextractofcompound8and9on
DPPH?radicals
2.3对MSCs的增殖活性
MTT是一种黄色的接受氢离子的染料,可作用于
活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素
C的作用下,四唑盐环开裂,被还原成不溶于水的蓝色
产物,并沉淀在细胞中,而死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,
不能将MTT还原.所以,蓝色产物的生成量仅与活细胞
数目成正比.采用MTT法测量细胞生长曲线,简单、快
速而准确.采用MTT法测定MSCs的增殖效果,结果见
表5.
表中第一行表示样品的浓度,如“9-1”表示化合物
9配成的样品浓度1μg/μL,“9-1”所在的列为该样品浓
度时5组平行吸光值数据,最后一行“contrast”表示各
列相应浓度时对照组吸光值.由表4中两个样品的四个
浓度1,5,10,15μg/μL活性数据分析得出结论:化合物8
在各种浓度下吸光度平均值都比对照组低,表明其对
图3化合物8和9对(
2
O
?－
)自由基清除效果
Figure3Scavengingeffectofextractofcompound8and9on
2
O
?－
radicals
表4化合物8,9和BHA清除羟基自由基数据表
Table4Scavengingeffectofextractofcompound8,9andBBAonOH?radicals
样品用量/μg样品浓度(μg?mL
－1
)A值平均A值抑制率/%平均抑制率/%SDMEAN±SD
0.1860.78477
0.1830.78824化合物810.833
0.197
0.1887
0.77204
0.78168630.0085290.782±0.009
0.2200.74543
0.2040.76394化合物910.833
0.199
0.2077
0.76973
0.75970070.0126930.760±0.013
0.1580.698
0.1990.62BHA10.833
0.184
0.18
0.649
0.6560.03960.656±0.040
No.9王光荣等：(E)-N-芳基-3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]咔唑的合成……981
图4化合物8,9和BHA清除羟基自由基效果
Figure4Scavengingeffectofextractofcompound8,9and
BHAonOHradicals
MSCs有抑制作用.化合物9在浓度为1μg/μL时,其吸
光度数据平均值远高于对照组,对MSCs的增殖有很好
的促进作用,随浓度的增大,出现抑制作用.因此,化
合物9在低浓度时对MSCs增殖作用值得进一步的研究
探讨.所有的数据使用均数±标准差(X±S)表示,采用
方差分析.带﹡代表柱状图数据的P＜0.05,说明有显
著差异,实验数据可信.化合物8和9对MSCs的调控
作用具体如图5所示
[31]
.
3结论
设计合成了3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲苯
图5化合物8和9对MSCs增殖作用的吸光值柱状图
Figure5Effectofcompounds8and9ontheproliferationof
MSCs
基咔唑(8)和3-[2-(8-羟基喹啉基)-乙烯基]-N-对甲氧苯基
咔唑(9)两个新的化合物,确定了该化合物的结构.并研
究了它们对DPPH?自由基、超氧阴离子自由基、羟基自
由基的清除作用,利用噻唑蓝比色法(MTT法)测定了目
标产物调控鼠骨髓间质干细胞(MSCs)增殖的作用.实
验发现,这两个化合物对DPPH?自由基、超氧阴离子自
由基和羟基自由基具有较强的清除能力,即目标产物有
较强的抗氧化活性;化合物9在低浓度时对鼠骨髓间质
干细胞增殖有较强的促进作用,随着浓度的增加,其抑
制鼠骨髓间质干细胞增殖作用明显;化合物8显示对鼠
骨髓间质干细胞有抑制作用.
表5化合物8和9的骨髓间质干细胞(MSCs)增殖活性(O.D.值)
Table5Effectofcompounds8and9ontheproliferationofMSCs
浓度9-19-59-109-158-18-58-108-15
10.3820.3200.5720.7221.0680.8311.8242.257
20.3860.3120.5830.7291.1090.7081.7092.202
30.3890.3160.5590.7341.0850.8531.7962.286
40.3910.3130.5610.7351.0420.8721.8672.300
50.3840.3190.5600.7271.0491.0391.8272.206
Contrast0.1930.2930.5680.7571.3311.4702.0542.332
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