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CCK8
（CellCountingKit8细胞增殖-毒性检测试剂盒）
使用手册
Cat.No.EC020Size:5ml(500T)
一产品介绍
CellCountingKit8简称CCK8试剂盒，是用于测定细胞增殖或毒性实验中活细胞数目
的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。
CCK8溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分，检测快速，毒性非常
低。CCK8基于水溶性四唑盐WST8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-
二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）。工作原理为：WST8在电子耦合试剂存在的情况下，可以被
线粒体内的脱氢酶还原生成橙黄色的甲臜染料（formazan）。甲臜染料能够溶解在组织培
养基中，与活细胞数量成正比。通过比色，可以动态地量化活细胞的数量，从而对细胞增
殖或药物毒性进行检测。
CCK法应用非常广泛，如药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以
及生物因子的活性检测等。
二使用前注意
1.首次实验时，建议先用几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK8试剂后的培养时间。
2.接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，
可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，
建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。
3.培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较
难显色，因此需要较长的CCK8反应时间或增加细胞数量(～10
5
个细胞/孔)。悬浮细
胞与贴壁细胞相比较难显色。对于悬浮细胞，在加入CCK8培养1-4小时后，可先
从培养箱中取出，目测染色程度或用酶标仪测定决定。若显色困难，可将培养板放回
培养箱，继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞，CCK8的培养时间一般为1-4小
时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度(根据细胞种类而定，需要摸
索一下条件)。注意：CCK8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。
4.有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加CCK8试剂时，
建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD值读
数。
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5.
，建议在加入CCK8试剂后轻轻振摇培养板。为了避免加样时由于CCK8试剂
在枪头上的残留所带来的误差，可以在加样前用培养基稀释CCK8试剂并混匀后加样。
6.
物的培养基进行比较(只加CCK8试剂)，如果OD值明显偏
高，则说明有反应。
7.培养基
后再加CCK8试剂。含有酚红的培养基不影响本试剂盒做细胞活性的测定。
8.，建议设定600nm(或600nm以上)作为参比波长，
扣除参比波长的OD值即可。
9.
，其他的实验，
例如中性红法或结晶紫法，也可在CCK8法检测完后继续进行。
10.如果要测定细胞的具体数量，建议先做一个标准曲线。
三使用方法
1.制作标准曲线
1)先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。
2)等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5
个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
3)
是实验的条
件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK8后的培养时间)。
00%
)
Ab：空白孔(不含细胞和毒性物质的培养基、CCK8)
2.细胞活性检测
加CCK8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留。为使CCK8试剂和培养基充
分混匀
CCK8试剂中的WST8会与还原剂反应生成WST8甲臜，如果实验中有还原剂，请
检查背景的OD值，即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK8试剂在一定
时间内检测，和不加药
若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的
如果样品为高浑浊度的细胞悬液
CCK8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加
深，OD值不断增加(注：活细胞内的脱氢酶是持续产生的)。另外
按比例(例如：1/2比例)依次用培养基
接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK8试剂培养一定时间后测定OD值，制
作出一条以细胞数量为横坐标(X轴)，OD值为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此
标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件
计算公式：
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细胞存活率=[(As-Ab]/(Ac-Ab)]×1
抑制率=[(Ac-As]/(Ac-Ab)]×100%
As：实验孔(含有细胞的培养基、CCK8、毒性物质)
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、CCK8、没有毒性物质
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1)培养箱预培养(在37℃，5%
CO
2
的条件下)。
2)入10μl的CCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的
读数)。
3)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
5)l
溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸
光度不会发生变化。
3.细胞增殖-毒性检测
1)μl的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养24小时(在37℃，
5%CO
2
的条件下)。
2)向培养板加入10μl不同浓度的待测物质。
3)将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(例如:6,12,24或48小时)。
4)向每孔加入10μlCCK8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数)。
5)将培养板在培养箱内孵育1-4小时。
6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
7)
溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光
度不会发生变化。
比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加
入药物后的空白吸收即可。
四常见问题
问题
在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)。将培养板放在
向每孔加
如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl的0.1MHC
溶液或者1%w/vSDS
在96孔板中配制100
如果暂时不测定OD值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10μl0.1MHCl溶
液或者1%w/vSDS
注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基，去
掉药物的影响。当然药物影响
回答
一个孔中应接种
多少个细胞？
当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔
(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量
不低于2,500个/孔(100μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实
验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加
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入CCK8溶液。
能否用384孔板进
，可以先将CCK8溶液稀释1倍，然后加入培养基体积20%
行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK8溶液，如果加入的CCK8
体积太少
的量。
能否用24孔板进
行试验？
可以。向各孔中加入培养基体积10%的CCK8溶液。
酚红会影响检测过扣除空白孔中本底
吗？
不会。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通
的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
CCK8与胸苷结合
检测之间是否有
于CCK8使用的检测原理与胸苷检测的不同，因
相关性？
有。然而，请注意由
此结果可能不同。
CCK8能否检测细lE.coli培养液中加入
菌细胞？
可以检测E.coli，但不能检测酵母细胞。向100μ
10μlCCK8溶液，并培养1-4个小时或过夜。
CCK8稳定吗？
CCK8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
如果需要长期保存，我们推荐-20℃的储藏条件。
如果没有450nm
的滤光片，还可以
使用哪些其他滤
还可使用450nm到490nm之间的滤光片。
光片？
如何减少由于
CCK8试剂在枪头
上或孔壁上的残
留所带来的误
可以在加样前用培养基稀释CCK8试剂并混匀后加样。
差？
CCK8是什么颜
色？
应该是粉红色。若颜色不一样，有可能会影响测定。
CCK8能否对活细
胞进行染色？
不能。因为CCK8的主要成分是一种水溶性的四唑盐(WST8)，并通
过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST8上。由
于生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK8不能对细胞进行染色。
CCK8检测溶液对
细胞是否有毒？
进行长时间培养时，先检测一下细胞在加入CCK8培养后的
CCK8溶液自身因为高浓度的PMS的存在而具有一点毒性。但是，加
到培养基中的CCK8是没有毒性的，因为被稀释了10倍。因此，长时
间的培养，如过夜或者培养数天是可以的。同一个细胞培养液在CCK8
检测后还可以用于其他细胞增殖检测，如结晶紫检测，中性红检测或
者DNA荧光检测等。由于每种细胞对于CCK8的耐受力都不同，因
此在需要
活力。
在做加药实验时，
药物对测定是否
有影响？如何解
证明药物有影响，可在加CCK8
决？
有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK8发生显色反应，增
加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培
养基中加入CCK8，测定450nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药
物的培养基(加CCK8)的吸光度高，则
之前更换培养基，去掉药物的影响。
每次测定的数值可能会有以下几个原因：1.当在培养箱内培养时，培养板最外一圈
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不一样，是什么原
因？如何解决？
数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/
的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最
外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。2.有可能会因为CCK8
沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK8后，轻轻敲击培养板以帮助
混匀。3.每孔的细胞
孔范围内摸索条件。
如何设定空白对
照？入CCK8，培养一
在不含细胞的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450nm的
吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药
物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加
定的时间，测定450nm的吸光度作为空白对照。
哪些物质会影响
CCK8的测定？的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收
即可。
当有还原性物质存在时会影响CCK8的测定，例如含有维生素C的
Glucose等(一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有
酚红存在
在实验中吸光度
值太高，如果不能
减少细胞数量，如
如：可以把加入CCK8试剂后
的培养时间由2小时缩短为1小时。
何解决？
可以缩短加入CCK8后的培养时间。例
设定参比波长的
目的是什么？必
度。设定参比波长的
目的是为了取出由于样品混浊所带来的吸收。
须设定吗？
不一定要设定。CCK8试剂在参比波长没有吸光
说明书上仅写了
96孔板的测定方
法，如果使用24
孔板或12孔板
应该加多少量
，
一般情况下建议加入CCK8试剂的量是培养基体积的1/10。
CCK8试剂？
在CCK8显色过程
中，如何终止反
应？
二烷基硫酸钠）溶液。注意：反应停止后，应在24小时之
有一下几种方法（96孔板）：①在显色反应后，将培养板放置4℃冰
箱内。②每孔加10μl0.1MHCL溶液。③每孔加10μl的1%（w/v）
的SDS（十
内测定。
必须预培养细胞
吗？
有人不做细胞预培养，
不一定。如果要向保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做
细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也
但在做标准曲线和检测时需要统一检测条件。
如果加入的药物
中含有金属，是否
会有影响？
应，使灵敏度降级。如果终浓
金属对CCK8显色有影响。当终浓度为1Mm的氯化亚铅、氯化铁、
硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反
度是10Mm的话，将会100%抑制。
CCK8试剂的保存
条件？从而影响检测结果，若经常使用可将试剂存放在4℃冰箱内
在避光条件下CCK8试剂在4℃可保存一年。如果需要保存较长时间
的话，推荐在-20℃下保存。但是CCK8若反复解冻和冰冻将会增加空
白吸收，
保存。
预培养后，更换培
养基需要细胞计密计数细胞的话，可以
一般情况下用胰蛋白酶处理对数增长期的细胞，用血球计数盘计数，
制备成一定浓度的细胞悬液即可。如果想要精
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数吗？预培养后取培养基用血球计数盘进行计数。
CCK8对于不同的
细胞，灵敏度是否
一样？
不一样，悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于贴壁细胞，一般加
入CCK8培养1-4小时吸光度已经很高，但对于悬浮细胞则可能吸光
度较低，可以通过延长CCK8的加入时间或增加细胞数量来解决。
悬浮细胞和贴壁
细胞在数量上有色比较容易，若细胞数量过大，有时吸光度会超过酶标仪
何区别？
悬浮细胞由于染色比较困那，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
贴壁细胞染
的读数。
应该每次做标准
灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。
曲线吗？
建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于
状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，
有时在药物作用
情况下，细胞已经
死亡，但是脱氢酶
的活性还在，是
能计算
否
细胞数
比真实值高，不能真实反映活细胞数量，建议采用别的方法
测定。
量？
不能。由于CCK8是通过和细胞内的脱氢酶进行反应间接反映活细胞
数量，如果细胞已经死亡，但脱氢酶的活性还在，则试剂测定的细胞
数量将会
实验之前，是否需
要先检测一下培
养基和CCK8是否
培养基和CCK8是否反应。一
般正常在的OD值应该在0.4以下。
会反应？
需要，可用一个孔检测一下，因为有培养基中可能含有氧化还原反应
的物质，在正式实验之前有必要先确认
如果OD值太低，
可以采取什么办
法？
：①适当增加细胞数量。②延长加入CCK8试剂
后的染色时间。
可以采取2个办法
五储存与安全
和冷冻会增加背景值，干扰实验测定。如需经常使用请将试剂存放在0-5℃的条件下。
六其他相关试剂
Enlight
TM
：超稳定、高灵敏ECL发光试剂。
七质量保证
行严格质量检验，并进行验证，以确保产品质
量。请用户使用前务必认真阅读本手册。
八使用限制
本试剂仅限科研用途。
CCK8在避光0-5℃的条件下可以存放1年，在-20℃条件下可以贮藏更久。反复解冻
CCAA试剂盒：细胞周期与凋亡检测试剂盒。
英格恩生物对CCK8试剂的每批产品实
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Rev.Date:03Nov.2015
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