miRNA靶基因预测与验证相关问题解答miRNA主要通过与靶mRNA的结合，或促使mRNA降解，或阻碍其翻译，从而抑制目的基因的表达。用生物
信息学方法准确快速地预测miRNA的靶基因，可以为研究miRNA功能提供线索。金开瑞提供miRNA靶基因的预测与验证相关课题服务
，通过荧光报告素酶活性检测，结合软件预测及蛋白验证，提高靶点预测的精确性及可行性。同是实验室沦落人，我们也会在实验中遇到各种问题，
作为好同志，我们一边失败着一边总结着，痛并快乐着。为了让帮助各位同学再也不需要经历我们所走的弯路，下面就总结一些荧光素酶实验中常见
的问题。1转染成功如何判断？共转染的几个质粒中，3''UTR质粒及Renilla质粒可通过最终的luc读值判断是否转染成功，而mi
RNA质粒或mimic的转染情况无法从最终的luc读值做出判断，因而针对miRNA，转染是否成功可用以下方法进行：i.如转入的mi
RNA带荧光标记如GFP，则可直接在转染后、细胞裂解前，显微镜下观察细胞荧光；ii.如转入的miRNA不带任何荧光标记，可考虑进行
miRNA的qRT-PCR检测，通过检测结果判断实验组2、4、6是否相对其对照组miRNA有显著过表达。iii.设置一个荧光质粒转
染参照组，同批转染一个组的细胞，间接反映出同批次实验的转染情况。2如何判断实验体系无异常，获得客观的实验结果？可以从以下几个方面来
考察实验结果的客观性：对照的2个实验组，即实验组1与实验组2luc表达情况应无显著差异；转染正常，质粒或mimic确保成功转染入
细胞；luc检测值在仪器检测线性范围内。3阴性结果如何理解？在确保实验体系无异常的前提下，如果最终检测到的结果是阴性结果，则基本
可以判断目的miRNA不能直接调控靶基因的表达，不死心的话就再做一次，如果仍然是阴性结果，死心吧。有的同学说我一次做出阳性结果一次
做出阴性结果咋办？那就恭喜你再重复吧，结果一直波动的话可能是实验系统或其他原因，4为何与文献报导有差异？实验中，我们往往会遇到无法
重复出文献中结果的问题，这是肯定的，不同实验室实验条件、实验材料、实验细节并不能确保与文献完全一致所致。因此，只要我们相信自己就行
。5实验体系是否可以优化？如何优化？该实验的关键点在细胞状态和转染效率，转染效率的优化可通过调整共转染质粒的比例或调整转染体系来进
行，设置合理的质粒转染量梯度，观察microRNA对靶基因的抑制是否存在剂量效应或是否存在变化趋势的一致性，从而使结论更加可靠。6
使用mimics的一些问题？有的同学喜欢使用mimics来做实验，其实mimics就是体外合成的成熟体miRNA，同样可以反转录，
用qRT-PCR来检测表达量，但是大家应该很少看到有文章把mimics的过表达量PCR结果放出来的吧，那是因为mimics的过表达
通常在数万到数十万倍，miIRNA通常会靶向结合许多靶基因，这么强的外源过表达肯定会引起严重的脱靶效应，给审稿人把柄质疑你吗？对于
这种找抽的行为大家肯定是积极规避的。质粒介导的miRNA过表达由于是模拟了前体在生物体内的剪切，其过表达通常在数十倍到数百倍，可能
引起的脱靶效应远没有mimics严重。7是否还有其他方法验证miRNA对靶基因表达的调控？验证miRNA对靶基因的调控，也可直接
检测miRNA过表达或下调表达后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的变化（WesternBlot方法）。 |
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