O引言
软枣猕猴桃(Actinidiaarguta)，为多年生落叶攀缘藤本植物，是珍贵的野生果中之王。软枣猕猴桃果面无毛，丰产性好，具有较强的抗寒性，病虫害少，是一种发展前景广的野生果树资源，其营养价值很高，果味独特鲜美，且富含蛋白质和多种矿物质，尤其维生素C含量很高。软枣猕猴桃的保健价值也很高，如可提高机体的免疫功能、抗癌、降血脂和血压、防治糖尿病等，也具有美容健美的功效。
软枣猕猴桃在东北目前仅有零星栽培，山区基本为野生状态，由于长期处于野生状态，资源面临枯竭。通过植物组织培养可对其进行快速繁殖，有利于软枣猕猴桃的大范围推广，具有很高的经济效益。
国内对猕猴桃的组织培养做了大量研究。对猕猴桃的离体培养，多为诱导芽产生植株，而诱导愈伤组织分化芽苗的研究很少。从激素种类看，细胞分裂素多采用ZT，很少用6-BA，细胞生长素采用NAA、IBA、IAA。张远记等对软枣猕猴桃的愈伤组织培养发现，茎段外植体容易愈伤化，但其愈伤组织难以分化，叶片外植体不易愈伤化，但其愈伤组织容易分化，并建立了完整的叶片和茎段的愈伤组织诱导及植株再生体系；李昌禹等利用软枣猕猴桃茎尖诱导出苗，以及诱导叶片产生愈伤组织，然后再分化形成植株；田新华等用腋芽进行繁殖表明，嫩芽对氯化汞较敏感，容易出现褐化现象；王大平等在猕猴桃组培苗生根培养的研究中，发现活性炭对猕猴桃组培苗生根有明显的促进作用。
本研究取野生软枣猕猴桃叶片、茎段为外植体，通过诱导愈伤组织，愈伤组织分化芽苗，及诱导芽产生植株，瓶苗生根等环节，建立野生软枣猕猴桃的快繁体系，并研究细胞生长素NAA对褐变的影响，以及将分化出的芽苗愈伤化对分化率的影响，以期为野生软枣猕猴桃的大规模繁殖提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验时间、地点
研究田间试验于2010年在晋中学院花房进行，室内试验在晋中学院生物学院植物组织培养实验室进行。
1.2试验材料
选择生长旺盛、无病虫害的健壮植株，摘取幼嫩叶片、茎段及带嫩芽的茎段作为供试外植体。
1.3试验方法
1.3.1消毒处理软刷刷净材料表面，饱和的洗洁精溶液浸泡15min。放入小烧杯中罩纱布后，流水冲洗30rain左右。再置于超净工作台上。嫩叶先用75%酒精灭菌30s，无菌水快速冲洗l遍，再用0.1%HgC1：灭菌2rain30s，无菌水冲洗5-7次。最后将叶片剪为1cm2左右的小块，叶片周围剪成齿状，叶子背面朝下，在无菌条件下接入培养基中，每瓶接种3-5块。
茎段先用75%酒精灭菌50s，无菌水快速冲洗1遍，再用0.1%HgC12灭菌5min，无菌水冲洗5-7次再将茎段用解剖刀刮去表皮，纵切成2-3份，髓部朝下，在无菌条件下接入培养基中，每瓶接种3-5个。
带嫩芽的茎段先用75%酒精灭菌40s，无菌水快速冲洗1遍，再用0.1%HgC1：灭菌4min，无菌水冲洗5-7次。再用无菌剪刀修剪茎段两端，在无菌条件下芽朝上接入培养基。
1.3.2培养基以MS为基本培养基，添加不同浓度的KT、6-BA、2,4-D、NAA、IBA，蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L，pH调至5.8。
1.3.3培养条件温度22-26qC，叶片愈伤组织诱导期间暗培养，茎段愈伤组织诱导及嫩芽诱导丛生芽每日光照16h，光照强度2000lx。
1.3.4培养方法
(1)愈伤诱导。将消毒灭菌过的叶片分别接种于MS基本培养基；附加不同浓度6-BA(0.3、0.5、0.8mg/L)和NAA(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0mg/L)组合，以及KT(0.3、0.5、0.8mg/L)和2,4-D(0.5、1.0、2.0、2.5mg/L)组合中培养，重复3次，然后观察不同激素配比对叶片愈伤诱导的影响。将消毒灭菌过的茎段接种于MS基本培养基加6-BA(0.3、0.5、0.8mg/L)和NAA(0.05、0.1、0.2mg/L)组合中培养，重复3次，10天后观察不同激素配比对茎段愈伤诱导的影响。
(2)愈伤分化。将诱导出的愈伤转接在MS培养基加不同浓度6-BA(0.3、0.5、0.6、1.0、1.5、2.0rag/L)分别于IBA(0.01、0.02、0.05mg/L)和NAA(0.03、0.05、0.07mg/L)组合，重复3次，观察其分化时间以及不同激素配比对愈伤分化的影响。
(3)初代培养。将消毒灭菌过的带嫩芽的茎段接种子MS培养基加6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)和NAA(0.05、0.1、0.2rag/L)组合中培养，观察幼芽生长情况。
(4)生根培养。将分化出的幼苗转接与1/4MS、1/2MS(或加NAA或IBA)培养基中，重复3次，观察生根结果。
(5)不同激素对愈伤组织褐化的影响。将愈伤组织接入MS加不同浓度的6-BA、NAA、2，4-D、IBA、KT、ZT中，重复3次，观察愈伤褐化情况。
(6)分化出的芽苗再次愈伤化对分化的影响。将分化出的芽苗茎秆或叶子接入诱导愈伤的培养基中使其愈伤化，再将长出的愈伤组织转接在分化培养基上，如此反复分化几代，观察其分化率。
1.3.5试验仪器LDZX型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂；压力表精度1.6级，型号LDZX-50FA)、无菌操作台（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司；洁净度≤3.5颗／L，>_0.5}trn的尘埃，噪声<63db(A);平均风速0.3-0.6m/s;振动<4gm;菌落数S0.5个／（皿．h））、电子天平（上海上平仪器有限公司；Max=1009，min=10mg，d=0.1mg，e=10d）、蒸馏水器(上海科析试验仪器厂，型号5L/h)、微量移液器(上海高鸽工贸有限公司；100~tL、500gL、1000gL)。
1.3.6统计分析
愈伤组织诱导率=（诱导愈伤组织个数／接种总块数）×100%……………(1)
愈伤组织分化率=（愈伤组织分化个数／接种总块数）×lOO%…………(2)
嫩芽发芽率=（幼苗发芽个数／接种总个数）×100%………(3)
幼苗生根率=（幼苗生根个数／接种总个数）×100%………(4)
2结果与分析
2.1不同外植体及植物生长调节剂对愈伤诱导的影响以．叶片为外植体诱导愈伤组织，叶片接种1周后如果叶片过嫩，在培养基上会逐渐长大、卷曲，10天后切口处陆续长出白色愈伤组织。在叶片愈伤组织诱导中，固定细胞分裂素的浓度，随着细胞生长素浓度的增加，愈伤组织的诱导率逐渐增加。因此，高浓度细胞生长素可以提高愈伤组织的诱导率。KT与2，4-D激素组合虽然可以诱导出愈伤组织，但诱导率低，并且愈伤组织在生长过程中从内向外会发黑产生褐化。6-BA与NAA的组合愈伤组织不仅诱导率高，发生时间也明显提前，而且在生长过程中不会产生褐化现象。在诱导愈伤分化中，因此较好的计片愈伤组织诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA。
以茎段为外植体诱导愈伤组织，茎段接种后慢慢变绿，10天后逐渐长出泡沫状的淡绿色愈伤组织。在茎段诱导愈伤组织过程中，光下比暗处容易诱导，被剖的茎段髓部诱导出的愈伤组织为透明白色，容易发黑分化率不高，周皮诱导出的愈伤组织为淡绿色，生长快且分化率高。诱导过程中会出现部分褐化，细胞分裂素6-BA过高，细胞生长素NAA过低都会使褐化加重，较好的茎段愈伤组织诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。
2.2愈伤组织的分化培养
将诱导出的愈伤组织转接到表2
不同激素种类和浓度的分化培养基上。在6-BA与IBA的组合中，培养10天左右，绿色愈伤组织上长出白色毛状组织，20天后开始分化不定芽，平均分化2～3个不定芽。在6-BA与NAA的组合中培养20天左右，愈伤组织膨胀连接在一块，40天左右愈伤组织上长出白色毛状组织，60天左右部分白色毛状组织和上面的愈伤变成黄色，然后长出卷着的叶子，慢慢长成油光发亮的不定芽，平均分化8-9个不定芽。
在6-BA与IBA的组合中，固定6-BA的浓度，随着IBA的增加愈伤组织的褐化会逐渐加重。固定IBA的浓度，6-BA从0.5mg/L增加到2.0mg/L，愈伤组织由开始只分化叶子到分化出芽苗。在6-BA与NAA的组合中，固定6-BA的浓度，NAA过低，则分化率下降，芽苗较弱，NAA过高则愈伤生长加快，分化率下降。固定NAA的浓度，6-BA过低则分化速度下降，6-BA过高则会出现轻微褐化。
在6-BA与IBA和6-BA与NAA组合中，都能分化出不定芽。6-BA与IBA组合虽然分化出不定芽所需时间短，但分化率低分化效果也不好，分化过程中愈伤组织会逐渐变黑褐化，愈伤再次转接分化，分化率会更低甚至不分化，在6-BA与NAA组合中不仅分化率高分化效果也很好，而且分化过程中愈伤不会变黑褐化，可以多次继代分化。因此，较好的愈伤组织分化培养基为MS+0.6mg/L6-BA+0.05mg/LNAA。
2.3茎段初代培养
带嫩芽的茎段接种2周后开始长出芽苗。可以看出，固定NAA的浓度，6-BA过高会使褐化加重，固定6-BA的浓度，NAA超过0.1mg/L，茎段底部会出现愈伤化。因此，较好的初代培养基为MS+I.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA。
2.4生根培养
将增殖分化的幼苗接入表5所示不同生根培养基中，观察记录生根情况。由试验结果可知，软枣猕猴桃芽苗在含不同浓度NAA和IBA的生根培养基中都不能生根，且幼苗愈伤化随浓度增高而加重。试验还发现，丛生芽比愈伤诱导出的幼苗生根容易。因此，I/2MS为较适宜的生根培养基。
2.5不同激素对愈伤褐化的影响
NAA对软枣猕猴桃愈伤生长有特殊作用，不仅可以加快愈伤生长，而且可以防止愈伤褐化，而其他激素都会使愈伤组织产生褐变。在初代过程中，NAA也可降低茎段褐化。6-BA与NAA的组合中，NAA在0.01～0.1mg/L范围内，调节6-BA的浓度从0.5～1.0mg/L的过程中，愈伤无褐化现象，超过1.0mg/L开时出现褐化。NAA超过1.0mg/L后与6-BA组合无褐化现象出现。
2.6分化出的芽苗再次愈伤化对分化的影响
将分化出的芽苗茎秆或叶子接入MS+0.5mg/L6-BA+1.0mg/LNAA使其愈伤化，再将长出的愈伤组织转接在MS+0.6mg/L6-BA+0.05mg/LNAA的分化培养基上，如此反复分化几代，观察其分化率。由表7可以看出，将分化出的芽苗再次愈伤化，第2代分化率明显提高，第3、4代都有所提高，但逐渐降低，直到第5代不再提高，且分化时间逐渐缩短，这说明连续将分化出的芽苗愈伤化可以提高分化率。
3结论
试验以野生软枣猕猴桃无菌叶片、去皮茎段、嫩芽为外植体，研究植物激素对于诱导愈伤组织、愈伤组织分化、茎段初代培养、幼苗生根以及不同浓度的激素对愈伤组织褐化的影响，以及分化出的芽苗再次愈伤化对分化的影响。结果表明：(1)诱导叶片、茎段愈伤组织的培养基分别为：MS+0.5mg/L6-BA+I,0mg/LNAA和MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA;愈伤组织分化不定芽的培养基为：MS+0.6mg/L6-BA+0.05mg/LNAA;诱导幼芽产生丛生芽的培养基为：MS+1.0mg/L6-BA+0,1mg/LNAA;较适宜的生根培养基为I/2MS;(2)将愈伤组织接入NAA、6-BA、IBA、2，4-D、KT、ZT不同浓度的细胞分裂素中，发现细胞生长素NAA可以防止愈伤褐化；(3)将分化出的芽苗再次愈伤化，接着用新诱导的愈伤分化，如此反复几代可以提高愈伤组织分化率。
4讨论
在以往各种猕猴桃的研究中多以芽诱导植株为主，而以叶片和茎段诱导愈伤组织再分化形成植株的则很少，有关猕猴桃褐化问题的报道也很少。张远记等一1在软枣猕猴桃组织培养中，表明茎段外植体较叶片易愈伤化，在本试验中并未体现，可能由于取材时间不同而导致。阳小成等在中华猕猴桃的组织培养及其实用快速繁殖中表明，加入聚乙烯吡咯烷酮和活性炭可以防止褐化。刘延吉等在研究软枣猕猴桃组织培养过程，外植体褐变的防止中发现，添加3%聚乙烯吡咯烷酮可以有效抑制褐化。
植物生长调节剂不同浓度对软枣猕猴桃生长及褐变有一定影响，高浓度的细胞分裂素刺激酚类产生，而生长素NAA、IAA能够延缓多酚合成，减轻褐变。本试验细胞生长素NAA可以防止愈伤组织继代中的褐变，可能由于NAA可以抑制多酚酶的活性，或者可以与酚类物质反应生成酯类，从而抑制其氧化成为醌类物质产生褐化，而野生软枣猕猴桃外植体和愈伤中有其反应的条件或促进其反应的物质。
组织培养的原理是细胞的全能性表达，而细胞分化也受遗传基因的调控，只是需要达到一定的条件这种基因才会表达。离体、植物激素刺激是组培必须的外部条件，这可能使细胞内部产生一定的条件，从而激活调控细胞分化的遗传基因，实现脱分化、去分化。许多植物组织培养，愈伤多次继代会影响其分化率。本试验让愈伤组织不断的脱分化、去分化，可能使这种内部条件更容易产生，调控细胞分化的基因更容易激活，从而提高分化率。
刘小刚，焦晋，赵宇，于建红，卫俐丹，程晓清，马晓丽(晋中学院)
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