【珍藏】用好“上帝的手术刀”，基因编辑干货送到说到基因编辑，大家可能立马会想到crispr/cas9技术，原因不用多说，各种文章的发表已经让
crispr/cas9技术“无所不能”。基因编辑技术的数量种类和实现的可行性方面都取得了巨大的进步，基因编辑技术的出现和不断更新
迭代使得研究复杂基因之间的相互作用成为可能，今天小编就如下基因编辑技术进行逐一介绍。1、锌指核酸酶2、TALENs3、Cre-Lo
xp4、CRISPR5、SleepingBeautytransposon锌指核酸酶锌指核酸酶（ZFN）代表了迈向高效，有针对性
的核酸酶的第一步。为了产生ZFN，设计了一系列锌指与特定基因组基因座结合，然后与FokI核酸酶融合。识别两个相邻位点的配对ZFN切
割DNA，从而启动HDR。最经典的锌指核酸酶是将一个非特异性的核酸内切酶FokI与含有锌指的结构域进行融合，其目的自然是对特定序列
进行切割。锌指识别三联体，FokI核酸酶作为二聚体起作用，在两个不同ZF目标位点之间的间隔区切开DNA。被切开的DNA可以由切除的
修复机制使切开处的单链部分被删除，然后又重新接到一起。理论上讲，我们可以利用这种方法完成对染色体上特定片段的删除，从而达到构造突变
体或完成治疗的工作。但是ZFN的效用受到合成时间长和非模块化组装工艺的限制。尽管计算工具有助于改善设计，但无法为每个基因组基因座设
计合适的ZFN对。TALENsTALENs在基因编辑技术上迈出了一大步。该模块系统基于从Xanthomonasspp分离的TAL
效应子DNA结合蛋白与FokI核酸内切酶融合。经验丰富的科学家制作ZFN可能需要六个星期的时间，而TALENs技术的出现使得新手可
以在短短几天内完成TALEN的构建。TAL中心靶向结构域由33-35个氨基酸重复序列组成。这些重复由两个氨基酸组成，彼此不同，也就
是它们的重复可变双残基（repeat-variabledi-residue，RVD）。最终，正是这种RVD决定了TAL效应子（T
ALe）将识别出哪个单核苷酸：sHD靶向胞嘧啶，NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶和NN靶向鸟嘌呤。由于ZF靶标仅限于由具有相应锌指
的三联体组成的序列，因此平均每500bp基因组中有潜在的可靶向位点。TAL效应子有一些限制，例如目标必须以T开头，但它们仍然具有大
约每35bp就可以找到潜在目标位点。Cre-LoxpCre-loxp是一个非常有趣的工具，该工具可用于在转基因动物，胚胎干细胞和/
或组织特异性细胞类型中创建特定的靶向DNA修饰。现已广泛用于控制基因表达，Cre重组酶在各种启动子的控制下或以其可诱导的形式对基因
表达进行复杂的时空控制，尤其是在转基因小鼠研究中应用尤为广泛。Cre-loxp系统由源自P1噬菌体的两个成分组成：Cre重组酶和l
oxP识别位点。Cre重组酶最初命名是因为它“引起重组（causesrecombination）”，后来也称之为“环化重组酶（
cyclizationrecombinase）”），它是一个38kDa的蛋白质，在loxP识别位点负责分子内和分子间的重组。该
系统的主要优势在于Cre的作用不依赖任何其他辅助蛋白或辅因子，因此可广泛用于各种实验中。LoxP（(LocusofX(cros
s)-overinP1）则是位于P1噬菌体中的34bp序列，由两个13bp的反向回文序列和8bp的中间间隔序列共同组成，核心序
列的不对称赋予了loxP位点具有方向性，典型的loxP序列为ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTA
T。loxP序列在除P1噬菌体之外的任何已知基因组中都不是天然存在的，并且由于足够长，几乎没有机会随机出现。因此，在DNA序列感兴
趣的位置插入loxP位点可以进行非常特殊的操作。具体原理：Cre重组酶介导两个loxP位点之间的位点特异性重组事件，这些位点可以位
于相同或不同的DNA片段上。单个loxP位点上的每个13bp重复序列均被Cre蛋白识别并结合，形成二聚体。然后，两个loxP位点
以平行方向排列，从而允许四个Cre蛋白形成四聚体。双链DNA断裂发生在每个loxP位点的核心间隔区内，然后两条链被连接，从而导致相
互交换事件发生。根据loxP位点的位置和方向，以下三种情景：?Inversion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反时
，Cre重组酶能诱导两个LoxP位点间的序列翻转；?Deletion：当两个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶
能有效地敲除两个LoxP位点间的序列；?Translocation：当两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体上，Cre
重组酶能诱导两条DNA链发生交换或染色体易位；However，从以上情景我们也可以看到在Cre酶存在时，三种情景的变化其实是可逆的
，那么该如何使这种动态变化达到一种稳定状态呢？如下图所示，通过引入两对不同的LoxP位点，经过两组LoxP点的两轮重组我们即可达到
一种稳定状态。也就可以通过Cre的存在与否来控制基因的表达了。具体原理如下：图中的白色箭头对应的是LoxP位点，黑色箭头对应的是L
ox-2722位点。这两种位点都能被CRE所识别，并在相同位点间发生重组，而不同位点之间不能发生重组。发生重组时，方向相反的两个位
点之间的序列会被颠倒，而方向相同的两个位点之间的序列被切除。在图中，假设第一次重组发生在LoxP位点之间，原本反向插入在启动子后的
目的基因（不表达），重组后变成顺式结构，能够被启动子驱动表达。第二次的重组发生在两个Lox-2722位点之间，它们的重组导致了中间
的LoxP位点丢失，同时只保留下一个Lox-2722位点。最后剩下的Lox-2722和LoxP位点之间不能发生重组，所以整个基因结
构便被固定下来。在这个基础上，也就产生了DO（Cre-off）、DIO（Cre-on）和Cre-Switch（Cre-off/on
）。这三种系统中，LoxP序列在同一条载体上，并且方向相同，只是外源基因的插入方向不同。?DO系统（Cre-off）插入基因与
启动子方向一致，在Cre重组酶存在的情况下会发生重组导致基因方向反向，因此基因不表达，所以称之为Cre-Off；?DIO系统（C
re-on）插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向与启动子方向
一致，才能使该基因表达，因此该系统称之为Cre-On；?FLEX系统（Cre-on）FLEX系统与DIO系统一致，只是LoxP位
点方向与DIO系统不同。插入基因方向与启动子方向相反，在Cre重组酶不存在的情况下不表达，只有当Cre酶存在时，发生重组使基因方向
与启动子方向一致，才能使该基因表达。?Cre-Switch系统（Cre-off/on）对于Cre-Switch来讲，则是在Lox
P序列之间插入了两个阅读框，而这两个阅读框的方向相反，则可以通过Cre酶的存在与否来控制这两个基因的表达。Cre-loxp系统说到
这里，说它是一个非常有趣的工具，大家都认同的吧？Cre-LoxP系统是在神经系统中应用最广泛的条件性基因敲除工具，Cre-loxp
系统优点如下：?高效性：Cre重组酶与具有LoxP位点的DNA片段形成复合物之后，可以提供足够的能力引发之后的DNA重组过程，重
组过程简约高效；?特异性强：LoxP序列的唯一性，保证基因重组的特异性；?应用范围广：Cre重组酶可以在生物体不同的组织、不同
的生理条件下发挥作用；?可由二型启动子启动表达：Cre重组酶的编码基因可由任何一种二型启动子驱动，由此保证Cre重组酶在生物体不
同的细胞、组织、器官或者在不同的发育阶段或不同的生理条件下表达，从而实现较高的组织和细胞特异性。Cre/loxp系统是一种完善的研
究工具，正由于Cre/loxp系统的上述优点，尤其是在转基因小鼠领域。下面列出了一些最常见的用途：?Cre依赖性基因表达：在目标
基因上游放置两边都带有loxP位点的终止密码子（通常称为“lox-stop-lox”或“LSL”表达盒），在没有Cre重组酶的
情况下，将阻止基因表达。在Cre存在的情况下，切除终止密码子，基因表达。?Cre依赖性基因敲除：将loxP位点置于基因的两侧（称
为“floxing”，意为“flankedbyloxP”），在Cre不存在时允许基因表达；当Cre存在时该基因表达将被破坏或
删除。?选择标记的去除：在常规的小鼠编辑中，通常使用选择标记进行目标克隆筛选，但是在初始选择过之后，通常希望删除标记。此时通过对
选择标记进行floxing处理，利用Cre可轻松执行此操作。?调节Cre表达：在发育的某些阶段通过将Cre置于特异性启动子下游，
或通过将Cre置于诱导启动子（例如强力霉素诱导表达系统），这样Cre重组酶只能在指定的细胞中或指定的时间表达，同时结合上述一些lo
xP使用方法，可以进行不同要求基因修饰。CRISPRCRISPR是细菌免疫系统的重要组成部分，可使细菌记住并破坏噬菌体。在基因编辑
应用中，Cas9核酸内切酶通过gRNA序列进行靶向，从而诱导双链断裂。像ZFN和TALENs一样，CRISPR/Cas9也使用HD
R，但是使用RNA来指定编辑使得该系统更便宜，更省时，更精确。与TALENs相比，CRISPR的应用更为广泛，每周都会有使用该技术
发表的新论文。CRISPR/Cas9系统有两个不同的组成部分：（1）指导RNA（gRNA）和（2）核酸内切酶，在上图中为Cas9。
当在细胞中表达时，gRNA/Cas9复合物通过gRNA之间的碱基配对募集到靶序列及其在基因组DNA中的互补序列。为了使Cas9成功
结合到DNA，基因组DNA中的靶序列不仅必须与gRNA序列互补，而且还必须紧随其后的是正确的PAM（protospaceradj
acentmotif）序列。请注意，PAM序列存在于DNA靶序列中，但不存在于gRNA序列中，任何具有正确靶序列且后接PAM序列
的DNA序列都将被Cas9结合。不同的cas9蛋白识别的PAM序列不同。Cas9SpeciesPAMsequence(5’
to3’)Streptococcuspyogenes(Sp)NGGStaphylococcusaureus(Sa)NG
RRTorNGRRNNeisseriameningitidis(Nm)NNNNGATTStreptococcusther
mophilus(St)NNAGAAWTreponemadenticola(Td)NAAAACCRISPR/Cas9技术存在
如下应用：1、导致双链断裂：完整功能的CRISPR/Cas酶将根据gRNA序列在特定位置引入双链断裂（DSB）。DSBs优先通过非
同源末端连接（NHEJ）在细胞中修复，该机制经常会导致DNA中引物插入或缺失（indels）。插入缺失会导致移码功能等位基因缺失。
2、导致单链断裂：CRISPR/Cas切口酶突变体导致Grna靶向的DNA单链断裂，而不是野生型Cas酶产生的双链断裂。使用切口酶
突变体，需要两个gRNA，两个Grna位于DNA的两条链，且两个gRNA的位置距离合适。3、碱基编辑：将dCas9与胞苷脱氨酶蛋白
融合，可以成为一种特定的碱基编辑器，可以改变DNA碱基而不会引起DNA断裂，该系统可以进行C->T转换（或相反链上的G->A转
换）。而2019年10月21日发表在Nature上面的文章"Search-and-replacegenomeeditingw
ithoutdouble-strandbreaksordonorDNA”，已经实现碱基任意转换与增删。4.激活上调基因
表达：将dCas9与转录激活肽融合可以增加特定基因的转录。合理设计gRNA序列以将dCas9激活子引导至感兴趣的基因的启动子或调控
区域，实现基因的上调。5、干扰下调基因表达：将dCas9与转录抑制肽（如KRAB）融合，可以通过干扰转录来降低基因表达。Sleep
ingBeautytransposon睡美人转座子（SleepingBeautytransposon）系统由两个部分组成：
1）SB转座酶，催化转座所需的酶；和2）含有可在基因组内移位的基因表达盒的转座子。睡美人转座子被证明是无需使用病毒载体即可产生特
定基因突变和基因破坏的令人兴奋的工具。睡美人转座子同样可用于基因组编辑，可以作为CRISPR/Cas9技术的一种有价值的替代工具，
并且睡美人转座子的使用可能会在未来几十年内有增长。如上图，（1）转座子由位于质粒主链中目标基因（蓝色）侧翼的一组反向重复序列（绿色
）组成。第二个质粒包含用于表达转座酶的转座酶基因（红色）。（2）转座酶表达（红色星号）并结合反向重复序列（绿色）；发生核酸内切酶反
应，切割DNA。（3）释放的转座子可以与带有TA二核苷酸DNA链结合（在人类基因组中有许多这样的位点）。除去转座子后，原始质粒为空
，然后质粒被细胞降解。（4）转座酶在DNA中产生双链断裂，并允许转座子整合。借助随手可得的多种强大有效的基因编辑方法，我们已经进入
了基因编辑的黄金时代。相信在以后会有越来越多的工作将注重于完善这些技术，以确保高特异性和高活性。参考资料：1.Genesis.
2000Feb;26(2):99-109.Crerecombinase:theuniversalreagentforgenometailoring2.Nature.2019Oct21.doi:10.1038/s41586-019-1711-4.Search-and-replacegenomeeditingwithoutdouble-strandbreaksordonorDNA3.Plasmids101:ADesktopResourceCreatedandCompiledbyAddgeneMarch2017(3rdEdition)4.CRISPR101:ADesktopResourceCreatedandCompiledbyAddgeneMay2017(2ndEdition) |
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