与多种疾病密切相关，环状RNA研究如何入手？环状RNA（CircRNA）是真核生物中具有组织特异性和细胞特异性表达模式的共价封闭内源性生物分
子，其生物发生受特定的顺式作用元件和反式作用因子调节。到目前为止，CircRNA被报道与人类多种疾病相关，包括糖尿病、神经系统疾病
、心血管疾病等。以发表于《NatureReviewsGenetics》的一篇综述“Thebiogenesis,biolog
yandcharacterizationofcircularRNAs”为例，小编今天为大家详细介绍circRNA的生成、
功能以及GOF和LOF的研究方法。一、CircRNA的生成CircRNA由称为“反向剪接”的非经典剪接事件产生。在反向剪接中，下游
剪接供体位点与上游剪接受体位点共价连接。尽管反向剪接被认为是可变剪切的一种，但它与线性可变剪接具有不同的分子机制。大多数CircR
NA从已知的蛋白质编码基因表达，并且由单个外显子或多个外显子组成，比如http://circrna.org/circBase?中的
绝大多数circRNA都只是由线性RNA的外显子组成。CircRNA的产生目前有以下三种机制：1.反向剪接（directbac
ksplicing）：外显子来源的CircRNAs通过反向剪接的特殊剪接方式产生，在反向剪接过程中，下游剪接供体位点与上游剪接受体
位点共价连接，形成磷酸二酯键产生一个环状的RNA分子。外显子来源的CircRNAs的产生强烈依赖具有长反向末端重复或结合RBPs的
内含子两种机制中的至少一种。这两种机制都让CircRNAs侧翼的内含子紧紧挨在一起。这主要通过反向重复元件（例如Alu元件）之间的
碱基对、RBPs的二聚体或RBPs与侧翼内含子中的特定基序结合是下游剪接供体位点与上游剪接受体位点接近。这就是通常所说的内含子配对
驱动环化和蛋白驱动的外显子环化，详见下图a；2.?外显子跳读形成套索结构驱动环状RNA分子的形成，详见上图b左；3.?在剪接过程中
从分支结构脱离的内含子形成套索结构也能够驱动环状RNA分子的形成，详见上图b右；二、CircRNA的功能目前认可度比较高的Circ
RNA生物学功能主要包括环状RNA作为microRNAsponge、单个环状RNA调控蛋白结合、环状RNA与蛋白相互作用及其编码
功能。1.?CircRNA作为microRNAsponge这篇文章中，鉴定出的ciRS-7含有超过70个mir-7的结合位点，
通过AGO2蛋白实现竞争性吸附miR-7进行调控靶基因表达水平。这一作用机制被称为竞争性内源RNA（ceRNA）机制。2.Cir
cRNA作为sponge调控蛋白结合这篇文章中提到的circMbl，具有mbl和MBNL1的结合位点。当mbl高表达时，会促进ci
rcMbl的生成而抑制线性转录本的表达，并且circMbl会与过量的mbl结合，使其含量趋于稳定。因此，可能存在一种自动调节回路，
其中过量的mbl或MBNL1通过促进circRNA生物发生而降低了其自身mRNA的产生，而circRNA通过结合mbl或MBNL1
来促进基因的线性剪接。3.调控基因转录circRNA与RNA聚合酶Ⅱ相互作用并调节转录，或者EIcircRNA可与小核糖核蛋白互
作用，再与RNA聚合酶Ⅱ结合。4.编码功能circRNA虽然属于非编码RNA，但也有部分circRNA可被核糖体翻译并编码多肽，
进而行使调控功能。三、GOF和LOF研究方法1.GOF(过表达)构建策略根据外显子环化原理，构建环状RNA过表达载体，研究侧翼内
含子序列，蛋白因子对环化的促进或者抑制作用。同样看这篇文章，该文章中列举了几种环状RNA的构建方法，每种方法都可以成环，只是表达倍
数不同。上图b构建了三种质粒，其中ciRS-7-fs由没有侧翼序列和剪接位点的ciRS-7外显子组成；ciRS-7-ir包括剪接位
点和内源侧翼基因组序列【上游1kb（kb），下游200bp（bp）】。在ciRS-7中，上游序列的一部分被反向插入下游，如方向
条所示。几种构建方法最终的ciRS-7的表达丰度有所不同。吉凯基因经过大量测试优化，已经开发出适用不同载体的circRNA构建方法
，我们可以将circRNA成功构建到质粒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体，欢迎前来咨询。2.LOF（RNAi）构建策
略功能丧失研究对于了解任何circRNA的功能和生物学相关性非常关键，并且通常涉及RNAi。靶向circRNAbacksplic
ingjunction的siRNA通常高效且对circRNA具有特异性，尽管使用化学修饰的siRNA（例如锁核酸RNA）可以提高
敲减效率或降低脱靶作用。为了验证circRNA的功能，可以使用RNAi干扰技术来有效沉默或抑制circRNA的表达，将RNAi靶点
设计在backsplicingjunction位置，可使用化学合成siRNA或者构建shRNA来达到功能丧失的目的。在这里，简单
介绍下circRNA的敲除策略，大多数circRNA均来自蛋白质编码宿主基因，这使circRNA特异性敲除变得复杂。如果已知对ci
rcRNA生物发生很重要的侧翼内含子基序，则从基因组中删除这些元素可以消除或减少circRNA表达，同时不会改变宿主基因的稳态RN
A水平，此时可以考虑使用敲除策略。但是，使用这种方法的前提是需要事先了解circRNA的生物发生，并仔细验证宿主基因的表达是否发生
改变。四、circRNA的检测在进行GOF或者LOF之后，需要验证过表达和敲减情况，通常需要设计Divergent引物进行检测。h
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RNA引物，欢迎前来订购。五、结语circRNA在生物学和病理生物学中很重要，circRNA的研究可以给我们带来很多令人惊讶的发
现。尽管大多数RNA序列尚未通过其他技术验证或进行功能研究，但目前已通过RNA-seq鉴定出了数千种不同组织和疾病中的circRN
A。通过学习借鉴文章“Thebiogenesis,biologyandcharacterizationofcircularRNAs”中描述的技术，将有助于我们对RNA-seq数据进行有效验证，并帮助我们发现circRNA生物学研究的新方向。 |
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