肝癌早期，总体DNA5-羟甲基胞嘧啶和5-甲酰基胞嘧啶含量降低胞嘧啶第五个位置（5mC）的甲基化是DNA的重要表观遗传修饰。研究表明，5m
C的氧化衍生物，即5-羟甲基胞嘧啶（5hmC），5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧甲基胞嘧啶（5caC）具有动态存在并具有独特的调
节功能。下面由武汉绿剑可瑞信科技有限公司，为各位读者带来一篇研究了肝细胞癌（HCC）基因组中所有3种5mC氧化衍生物的含量是否有变
化的研究长文，以助各位读者了解5-hmC相关的研究热点。研究背景DNA甲基转移酶（DNMT，包括DNMT1，DNMT3A和DNMT
3B）产生的胞嘧啶第五号位的甲基化（5mC）是DNA的重要表观遗传修饰。异常的DNA甲基化特征表现为全基因组的低甲基化和区域性高甲
基化，常见于各种癌症中，这与肿瘤的发生和发展密切相关[1]。近年来，有研究发现在哺乳动物基因组DNA中发生羟甲基化（5-羟甲基胞嘧
啶[5hmC]），并且通过ten-eleven易位家族酶（TET，包括TET1，TET2和TET3）活性催化5mC产生5hmC。此
外，TET酶需要氧气，Fe（II）和α-酮戊二酸（α-ketoglutarate，α-KG）才能催化5mC氧化，而与α-KG具有结
构相似性的2-羟基戊二酸（2-hydroxyglutarate，2-HG）的积累可以发挥抑制作用[2]。在整个基因组中，5hmC
的含量比5mC低一个数量级。据报道，肿瘤组织中基因组5hmC的含量总体上降低了[3]。尽管这可能是由于突变体Tets的催化活性降低
或TETs表达的降低所致[4]，但仍缺乏对确切机理的全面了解。此外，研究者[5]和其他[6]发现，TET可将5hmC进一步氧化为5
-甲酰基胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），两者在哺乳动物基因组中均比5hmC低约2个和3个数量级。5fC和5caC可以
通过胸腺嘧啶脱氧核糖核酸DNA糖基化酶（TDG）去除，然后用未修饰的胞嘧啶取代，以完成活性脱甲基过程[4,5]。肿瘤细胞基因组中5
fC和5caC的含量是否会改变还没有被报道。基因组中5hmC，5fC或5caC的特定生理功能尚不清楚。但是，有证据表明，这些氧化的
胞嘧啶并不是DNA脱甲基化的酶促过程中的瞬时中间体，而是整合到基因组DNA中的，可以稳定存在并且可以在哺乳动物基因组中发挥独特的调
节功能[4]。例如，5fC的全基因组图谱确定了5fC在活性增强子上的富集，并揭示了其在表观遗传启动中的可能作用[7]；确定了许多5
hmC，5fC或5caC的阅读器，包括转录调节因子，DNA修复因子和染色质调节因子。5hmC，5fC和5caC和5hmC，5fC和
5caC可能会通过募集它们的特定结合物或阅读器来发挥不同的表观遗传信号传导功能[8]。此外，5fC和5caC可以降低RNA聚合酶I
I转录的速率和底物特异性。肝癌（Hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球第六大最普遍的癌症，也是第三大最常
见的癌症，每年估计有500,000-600,000例死亡[9]。B型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）是HCC的主要原因。
亚洲和非洲国家，尤其是中国，通常表现出以HBV为主。对于与HBV相关的HCC，人们认为遗传和表观遗传改变均通过HBV引发的直接和间
接机制在肝癌发生中起着至关重要的作用。在此报告中，研究者发现，与癌旁组织相比，HCC组织中的总体基因组5hmC含量较低，HCC组织
中的5fC含量也有所降低。此外，发现HBV感染可加剧胞嘧啶修饰的异常。材料和方法患者和肝癌样本配对的HCC原发样本和邻近的正常肝组
织取自在上海东方肝胆外科医院接受手术切除的106例患者，并在-80°C下冷冻保存直至使用。通过医院的档案系统和电话随访收集患者的档
案和预后信息。第1组有54例原发性HCC患者，这些患者从2009年至2011年接受手术切除，并具有完整的随访数据，包括48例小HC
C（3厘米）。2016年，第2组中有52例较新的原发性HCC患者接受了手术切除。其中大多数（48/52）患有大HCC。最大的肿瘤直
径为3-18cm，所有肿瘤均处于A或B期（巴塞罗那临床肝癌[BCLC]分期）。1组和2组中大多数患者有HBV感染史(1组中，48
/54乙肝核心抗体(HBcAb)+；在2组中，51/52HBcAb+)。这些患者的详细临床病理信息如表1所示。这项调查得到了东方
肝胆外科医院伦理委员会的批准。手术前已获得患者的知情同意。表1.患者临床特征在某些病例中，没有一些临床变量数据。结果在HCC早
期，总体基因组5hmC和5fC含量显著下降从配对的HCC组织和邻近的癌旁组织中提取全基因组DNA，然后进行UHPLC-MS/MS分
析以检测DNA胞嘧啶修饰（5mC，5hmC，5fC和5caC）。与报道的结果一致[10]，第1组的HCC组织中5hmC的含量与癌旁
组织相比明显降低（图1A）。值得注意的是，与癌旁组织相比，HCC组织中5fC（通过TET酶促氧化生成5hmC的产物）的含量也显著降
低（图1B）。因此，研究者展示了癌症基因组中总体5fC含量的变化。HCC组织中的5caC含量低于仪器的检测阈值。图1.肝癌早期总
体基因组5hmC和5fC含量降低为了探讨在不同肝癌阶段5hmC和5fC的总体含量是否存在显着变化，研究者比较了在不同BCLC阶段（
0，A和B）之间肿瘤和癌旁组织中5hmC或5fC的含量。第1组的结果表明，在非常早期（0阶段），与癌旁组织相比，HCC组织中5hm
C含量显着降低。在0，A和B期之间，肿瘤组织中5hmC含量没有明显变化（图1?C）。但是，除了在非常早期（0期）外，A期肿瘤组织中
的5fC含量与0期相比显著下降，但A和B期没有显著差异（图1D）。为了证实这些结果，研究者选择了52名较新的患者（第2组），所有
肿瘤均处于A或B期（BCLC分期，表1）。同样，与癌旁组织相比，该组中基因组5hmC和5fC的总体含量显著下降。然而，在肝癌组织和
癌旁组织中，A期和B期之间的5hmC或5fC含量均无明显变化。综上所述，这些结果表明，HCC基因组DNA中5hmC和5fC含量的总
体下降发生在HCC的非常早期（BCLC分期为0），并且5fC水平从HCC的第0期到A期进一步降低。HCC基因组DNA中5hmC和5
fC含量的下降与HBV感染有关血液中HBVDNA的检测被认为是即时HBV感染状态的更准确指标。根据HBVDNA水平，将患者分为
HBVDNA低组和HBVDNA高组。在第1组中，研究者发现在HCC的早期阶段（BCLC第0和A期），尽管两组癌旁组织中5hmC
和5fC的含量没有显著差异，但HCC组织中5hmC和5fC的含量却是在高HBVDNA组中，其下降更为明显（图2?A，B）。然而，
两组在HCC后期（第2组，≥3cmHCC和BCLC分期A和B）之间的差异变得微不足道。图2.肝癌中5hmC和5fC含量的下降与
HBV感染有关为了确认HBV感染是否确实导致HCC细胞中5hmC和5fC含量降低，研究者分析了已与HBVDNA整合的两种HCC细
胞系。一种细胞系是HepG2.2.15，与完整的HBVDNA?整合在一起。另一个是与基因HBx整合的Huh7。?HBVX蛋白（
HBx）是调节HBV活性的关键决定因素。研究者发现，与原始细胞相比，整合了HBVDNA的两种细胞系的基因组中5hmC和5fC的总
体含量均显著降低（图2?C，D），下降幅度甚至超过HCC组织（将图2?C，D与图2A，B进行比较）。综上所述，这些结果表明，HC
C肿瘤细胞基因组DNA中的5hmC和5fC含量降低，并且HBV感染可能引起更严重的异常。随后，在初步工作中，研究者研究了潜在的机制
。总体基因组5mC含量在HCC早期下降，并与HBV感染有关众所周知，癌细胞表现出全基因组的低甲基化，并且先前的报道表明，肿瘤组织中
基因组中总体5mC含量降低了，其中包括HCC。研究者还分析了第1组和第2组患者肝癌组织中5mC的总体含量。发现与癌旁组织相比，5m
C含量在1组早期HCC组织中显著下降，而在2组中则是略有下降（图3A）。在肿瘤组织和癌旁组织中，5mC含量与5hmC含量呈正相关，
5hmC含量与5fC含量呈正相关，这表明5hmC和5fC降低的重要因素是由于5mC的降低。图3.HBV感染与HCC总体基因组5m
C降低有关有趣的是，研究者发现HBV感染也与5mC下降有关。在HBVDNA高水平组中，肝癌组织早期的5mC含量显著降低（图3?B
）。与该结果一致的是，与HBVDNA整合的细胞系与原始细胞相比也显示5mC含量显著降低（图3?C）。综上所述，这些结果表明，HC
C中5hmC和5fC的下降可能部分是由于5mC的下降，因为从5mC逐渐产生5hmC和5fC，而HBV的感染可能加剧了这种下降。肝癌
中Tet基因的表达水平和α-KG含量降低研究发现，在包括HCC在内的多种肿瘤中，TET酶的表达水平均降低。研究者还研究了第1和2组
中HCC组织中DNA甲基化相关酶的基因表达水平。与癌旁组织相比，肿瘤组织中TET2的表达水平显著下降（图4?B），但是仅在第2组中
发现TET1和TET3表达略有下降（图4A，C）。尽管发现HBV感染对HCC肿瘤组织中TET酶的表达没有显著影响，但观察到整合有H
BVDNA的两种细胞系中TET2和TET3的表达均下降。然而，奇怪的是在整合了HBVDNA的细胞系中TET1表达显著增加，这可
能是对细胞培养过程中TET2和TET3表达同时下降的一种补偿性反应。HBV对HCC肿瘤组织和HCC培养细胞中TET表达的不同影响可
能是由于细胞状态和细胞微环境的不同所致。图4.肝癌组织中Tet基因的表达水平和α-KG含量降低在存在独特的代谢物，辅因子和翻译后
修饰的情况下，可以刺激或抑制TET酶的活性[4]。有证据表明，α-KG是TET酶的主要辅因子和共底物，是调节5hmC动力学的关键因
素。研究者还使用UHPLC-MS/MS检测了HCC肿瘤和癌旁组织中α-KG的含量。研究者发现，与癌旁组织相比，肿瘤组织中的α-KG
含量明显降低（图4D）。此外，有趣的是，α-KG的突变产物和拮抗剂2-HG[41]与癌旁组织相比，肿瘤组织里的含量略微增加且微不
足道。两种变化的影响（α-KG含量的减少和2-HG含量的增加）是一致的，并且都可能导致TET酶活性降低。研究者观察到HBV感染对肝
癌组织中α-KG或2-HG含量无显著影响。综上，TET酶的表达降低和α-KG的含量降低（可能是2-HG的含量增加）可能减弱TET酶
的催化活性，导致HCC基因组DNA的5hmC和5fC含量降低。HCCDNA甲基化相关酶的不协调表达现已知道，DNA甲基化和活性脱
甲基化受到一系列与DNA甲基化相关的酶的调节，这些酶包括DNMT，TET，也许还有DNA脱甲基化的TDG。DNA甲基化模式的精确调
节对于正常发育很重要，并为细胞转化提供了基本的保护。研究者先前发现DNA甲基化相关的酶在正常小鼠和人类组织中呈正相关，而来自癌症基
因组图谱和基因型组织表达数据库的基因表达RNA测序数据表明，这些相关性在肿瘤组织中通常低于相应的正常组织中。但是，肝癌组织中的这些
相关性并不比正常肝组织中的显著低。考虑到使用定量RT-PCR进行直接定量RNA检测是确定差异基因表达的金标准，研究者还使用定量RT
?检查了其他四种与DNA甲基化相关的酶（TDG，DNMT1，DNMT3A和DNMT3B）的表达（除上述三种TET酶外）。值得注意的
是，研究者发现大多数这些酶的表达水平在癌旁组织中呈显著正相关，但这些相关性通常在HCC组织中减弱或消失，尤其是TET与DNMT1或
TDG之间的相关性（图5）。此外，根据HCC组织中5hmC或5fC的中位数含量将1和2组中的所有患者分为高组和低组。酶对TET1-
TDG，TET1-DNMT1，TET2-TDG和TET2-DNMT1在确定5hmC和5fC含量时可能具有直接作用。发现与高组相比，
5hmC或5fC低组中这些酶对之间的相关性进一步下降（5hmC中TET2-DNMT1的相关性除外）。综上所述，这些结果表明，DNA
甲基化相关酶的不协调表达也可能与HCC基因组DNA中5hmC，5fC或5mC含量的降低有关。图5.肝癌中与DNA甲基化相关的酶的
表达水平之间的相关性较低HCC基因组DNA中5hmC和5fC含量降低与患者预后不良有关据报道，肿瘤组织中5hmC的降低与预后不良有
关。我们发现，除了5hmC的，基因组DNA中的5fC含量与预后有关。肝癌组织中5hmC或5fC含量低的患者的无病生存率（DFS）和
总生存率（OS）分别比高5hmC或5fC的患者差（图6）。此外，研究者还发现，癌旁组织中5hmC或5fC的含量与OS相关，但仅癌旁
组织中5fC含量的降低与差的DFS显著相关。图6.根据肝癌组织中5hmC或5fC水平对肝癌患者进行生存分析讨论在本研究中，发现在
HCC组织的早期，总体基因组5hmC和5fC含量降低。这种降低的潜在机制包括：（1）降低5mC含量；（2）TET2酶的表达水平降低
，TET酶的辅助因子α-KG含量降低；（3）DNA甲基化相关酶的表达不协调；（4）HBV感染，可能间接感染。此外，研究者发现5hm
C和5fC含量的降低与HCC预后差有关。在这项研究中，研究者报告了HCC基因组中总体5fC含量的减少。这种下降在理论上是可以预料到
的。由于5fC是5hmC的下游氧化产物，也是由TET酶催化的5mC氧化产生的，因此从理论上讲，由于肝癌组织中5hmC含量降低，可能
降低5fC。实验结果也支持这一预测。发现在肝癌和癌旁组织中5fC和5hmC含量均呈正相关，在肝癌组织中两者均下降。此外，肝癌组织中
TET酶的表达水平和α-KG含量均降低（图4），进一步促进了5fC含量的降低。由于据报道5hmC在多种癌变组织中减少，预计，除了H
CC外，这些癌组织中的5fC也可能相应减少。结果表明，5fC（5mC的更下游氧化产物）的变化与HCC中5hmC的变化相似。首先，与
癌旁组织相比，两者在肝癌组织中的含量均明显降低。其次，其降低的潜在机制是相似的：它们是由同一类酶（TET）产生和催化的，并且5hm
C或5fC与它们的直接底物（5hmC和5mC，5fC和5hmC）之间存在显著的正相关。最后，它们的变化与肝癌患者的预后显著相关。但
是5fC和5hmC含量在HCC中表现出不同程度的变化。例如，肿瘤组织中5hmC的含量在HCC的早期（BCLC第0期）显著降低，并且
在此阶段之后（BCLC第0至A和A至B期）没有明显改变（图1）。另外，在癌旁组织中5fC的含量揭示了HCC患者的DFS值与在癌旁5
hmC的含量相反。由于5hmC和5fC通过募集特定的结合物或“阅读器”发挥不同的表观遗传信号功能，研究表明，5fC的全基因组分布不
同于5hmC，5hmC的和5fC可以具有可能与癌症的生物标志物组合使用，可能比使用的一种标志物更为精确。涉及更多具有预后信息的HC
C患者的进一步研究可以准确地评估这些表观遗传标记组合的潜在临床应用。研究发现，HBV感染与肝癌中5mC，5hmC和5fC含量的降低
有关。HBVDNA整合细胞系的结果进一步证实了这种关联。由于HBV对Tet基因的表达和α-KG和2-HG含量影响不大，因此HBV
可能主要影响5mC含量的下降（这一现象更为明显）。在HBVDNA整合细胞系中，可能导致5hmC和5fC含量进一步下降。换句话说，
HBV对5hmC和5fC含量的直接影响似乎很小。在HCC的早期发展中，HBV可能会影响肿瘤细胞中5mC的含量，在随后的HCC阶段（
BCLCA和B阶段）中，HBV的含量似乎很小。通过进一步分析该研究的临床和实验数据，观察到肝硬化（HCC发生的后期事件）与5mC
，5hmC或5fC含量之间没有显著关联（数据未显示）。与该观察结果一致的是，HBV可能在肝转化中起直接作用（HCC发生的早期事件）
，而非肝硬化性肝中可能出现HBV相关的HCC。总之，降低5mC，5hmC和5fC的含量更可能与肝癌的早期发展有关。据报道，HBV可
影响DNMT的表达或活性。然而，这些报告的结果是矛盾的和混乱的。分析了三个转移酶基因（DNMT1，Dnmt3a和Dnmt3b）在
HCC肿瘤和癌旁组织中的表达水平，发现这些基因在肿瘤组织中的表达没有明显降低，并且HBVDNA水平与这些基因的表达水平之间也没有
显著关联（数据未显示）。有趣的是，在先前报告的31例未感染HBV或HCV但有饮酒史的HCC患者中，观察到HCC的总体基因组5mC和
5hmC含量均下降，表明HBV感染不是HCC中总体5mC含量下降的原因。HBV感染与HCC基因组DNA总体5mC含量降低之间的潜在
联系和机制有待进一步研究。总基因组5mC，5hmC和5fC含量可以通过TET酶的表达水平和这些酶的活性来确定。结果表明，在HCC中
，这些含量均发生了改变。例如，发现与癌旁组织相比，HCC肿瘤组织中TET2的表达水平显著降低（图4?B），并且还发现HCC肿瘤组织
中DNA甲基化相关酶的表达不协调（图5）。此外，发现HCC肿瘤组织中的α-KG含量明显降低（图4D），这可能导致TET酶活性降低
。但是，除了在本研究中的研究内容外，还需要在进一步的研究中确定可能影响5mC和5mC氧化衍生物含量的其他因素，例如，那些影响DNM
T酶活性和甲基化相关酶基因突变的代谢物。总之，本研究系统地报告了肝癌基因组中5mC氧化衍生物的总体含量变化及其可能的潜在机制。该研
究提供了对HCC发展过程中DNA5mC氧化衍生物变化的潜在机制的洞察力，因此可以进行更广泛的探索。肝癌中5fC含量的变化或5hm
C含量的变化可能对评估HCC患者的预后具有潜在的价值。可以设计涉及更多HCC患者的进一步研究，以检测5mC氧化衍生物发生变化的确切
基因组区域，这可能与HCC的发展和患者的预后有关。[1]Iacobuzio-DonahueCA.EpigeneticCh
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