低氘水抑制宫颈癌Hela细胞增殖和侵袭能力的研究作者：张力张瀚彬陈淼等来源：《中国医药导报》2014年第09期
????????广东医学院中美肿瘤研究所，广东东莞523808
????????[摘要]目的探讨培养基中氘浓度的下降对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力的影响。方法用含不同氘浓度的培养基培养Hela细胞，分为150×10-6、100×10-6、75×10-6和50×10-6共4组，其中，氘浓度为150×10-6的培养基为对照组，其他为实验组；用四甲基噻唑蓝（MTT）法、划痕实验检测随着培养基中氘浓度下降，Hela细胞增殖和迁移侵袭力的变化；流式细胞术检测含不同氘浓度的培养基对Hela细胞周期的影响；蛋白免疫印迹和免疫组化实验检测含不同氘浓度的培养基对Hela细胞肿瘤相关蛋白p21、Na+/K+-ATPase表达的影响。结果MTT实验结果显示，随着培养基中氘浓度的降低Hela细胞增殖得到明显的抑制，其中氘浓度为50×10-6的培养基抑制效果最明显，相同条件下与对照组相比在72h抑制率达到39.54%（P<0.01）；划痕实验可观察到Hela细胞在氘浓度为75×10-6、50×10-6的培养基中细胞迁移能力得到明显抑制（P<0.05）；Hela细胞在氘浓度为75×10-6、50×10-6的培养基中培养24h后，流式细胞术检测S期明显低于对照组（P<0.01）；Hela细胞肿瘤相关蛋白p21在氘浓度为100×10-6、75×10-6和50×10-6的培养基中的表达与对照组比较，差异均有高度统计学意义（P<0.01）。结论培养基中氘浓度的下降对宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭能力有明显的抑制作用。
????????[关键词]低氘水；Hela；增殖；p21蛋白
????????[中图分类号]R739.6[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2014）03（c）-0020-06
????????Researchofinhibitionofdeuterium-depletedwaterforcervicalcancerHelacellproliferationandinvasiveness
????????ZHANGLiZHANGHanbinCHENMiaoWUYongfuHUANGHaohaiZHUBaohuaYANGHuiling
????????Sino′AmericaCancerResearchInstitute，GuangdongMedicalCollege，GuangdongProvince，Dongguan523808，China
????????[Abstract]ObjectiveToexaminetheeffectsoftheproliferationandinvasivenessinHelacelllinesbythedeuterium-depletedwater（DDW）.MethodsTheHelacelllineswereculturedinthepresenceofmediacontainingdifferentconcentrationsofdeuterium（150×10-6，100×10-6，75×10-6and50×10-6），whilethe150×10-6concentrationofdeuteriumwastakenasthecontrolgroup，theotherconcentrationsofdeuteriumweretakenastheexperimentalgroup.MTTandwoundscratchassaywereusedtoexaminetheeffectsofDDWontheproliferationandmigrationofHelacells.Moreover，theflowcytometrywasusedtodetecttheeffectsofDDWonthecellcycleofHelacelllines.Finally，theexpressionlevelsofp21andNa+/K+-ATPasewereassessedbyusingWesternblotandimmunohistochemistry.ResultsTheproliferationofHelacellswassignificantlysuppressedwhenculturinginthreeconcentrationsofDDW（100×10-6，75×10-6and50×10-6）medium，theinhibitioneffectwasobviousin50×10-6concentrationofDDW，the72hinhibitionratiowas39.54%（P<0.01）.TheresultofwoundscratchassayshowedthattheinvasivenessabilityofHelacellswassignificantlydecreasedin75×10-6and50×10-6concentrationofDDW（P<0.05）.CellcycleanalysisrevealedthatDDWcausedcellcyclearrestanddecreasedtheamountsofcellsintheSphaseafter24hcultivationin75×10-6and50×10-6concentrationofDDW（P<0.01）.Westernblotsuggestedthatcomparedwiththecontrolgroup，DDW（100×10-6，75×10-6and50×10-6）couldup-regulatetheexpressionofp21（P<0.01）.ConclusionThedecreasedofdeuteriumconcentrationinthemediumcansignificantinhibittheproliferationandinvasivenessofHelacells.
????????[Keywords]Deuterium-depletedwater；Helacells；Proliferation；p21protein
????????宫颈癌是全球女性恶性肿瘤中第3位最常见的癌症，也是导致女性癌症患者死亡的第4大原因，并占了近10%的新诊断癌症病例和8%的癌症死亡总数[1]。全球宫颈癌发病率在1980年每年约378000例，到2010年已增加到每年约454000例[2]。据估计每年我国新发宫颈癌病例约100000例，占世界子宫颈癌新发病例总数的1/5[3]。目前宫颈癌的主要治疗手段是手术、放射治疗和化学药物治疗。
????????在自然界中，水是由氕（H）和氘（D）两种氢的非放射性稳定同位素和氧组成的化合物。氘与氧组成的水称为重水，天然水中，氘和氕的比率（D∶H）大约是1∶6600，即自然界水中氘的体积分数为0.0139%～0.0151%[4-8]。因此，把氘体积分数低于0.015%的水称为低氘水（DDW）。由于氘对氕在质量上相差约1倍以及C-D键比C-H键牢固不易断裂，水中同位素氕和氘含量的变化会导致水的物理化学和核性质显著差异。有研究表明，氘能置换生物体内的氕并蓄积下来，随着生物体内氘浓度的增加，氢键间交联发生改变，从而使细胞质刚性显著增加，有丝分裂受阻滞[9-12]。饮用DDW可以预防疾病、延缓衰老、活化机体免疫细胞[13-14]。近年国外核医学领域和水生理学领域对DDW在某些癌症等疾病的辅助治疗的应用研究有了重大突破[15-18]。本文中将比较多种含有不同浓度氘的培养基对Hela细胞株生长影响。
????????1材料与方法
????????1.1试剂与材料
????????DDW（体积分数为0.005%，50×10-6）购自上海奥特泉公司；胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；宫颈癌细胞株Hela购自美国ATCC，并由中美肿瘤所保种；DMEM、RPMI1640培养基购自Gibco公司；PI染料购自北京索莱宝公司；核糖核酸酶A（RNaseA）购自Invitrogen；MTT试剂盒购自北京索莱宝公司；p21Waf1/Cip1（12D1）RabbitmAb购自CellSignaling；β-actin（13E5）RabbitmAb购自CellSignaling；AlexaFlour800goatanti-rabbitlgG（H+L）购自Invitrogen；Na+/K+-ATPaseɑ（H-3）mousemonoclonallgG2b购自SantaCruz；免疫组化试剂UltraVisionQuantoDetectionSystemHRPQuanto&DABQuanto购自ThermoScientific；其他试剂均为进口分析纯。
????????1.2细胞培养及实验分组
????????宫颈癌Hela细胞培养于含有10%FBS的1640培养基中，置于含5%（体积分数）CO2的37℃培养箱培养。DDW（100×10-6、75×10-6、50×10-6，实验组）与普通超纯水（150×10-6，对照组）按体积比分别配置成用于Hela培养的1640培养基。
????????1.3MTT法检测DDW对细胞增殖活性的影响
????????用不含血清的1640培养基饥饿培养Hela细胞24h后，用含乙二胺四乙酸（EDTA）0.25%胰酶消化，计数，以5×103个细胞/孔的密度接种于96孔培养板中，每孔分别加入100μL含10%FBS普通1640培养基（150×10-6，对照组）或含不同氘浓度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）1640培养基（实验组），各设3个复孔，置于37℃、5%（体积分数）CO2培养箱中培养24、48、72h后，每孔加入20μLMTT溶液继续培养4h，吸去培养液，每孔加100μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，选择490nm波长，测定各孔的光密度（OD）值。结果取3次实验平均值。计算DDW对细胞的增殖抑制率。抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%。
????????1.4细胞划痕实验
????????按实验“1.3”项下方法收集细胞加入6孔板中，密度为6×105个细胞/孔。用10%FBS普通1640培养基（150×10-6，对照组）及含不同氘浓度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640培养基（实验组）进行培养12h。等细胞贴壁完全后，用移液枪的10μL无菌枪头在各个孔内轻划一条直线，在同一放大倍数下测量直线宽度并做好记录，作为0h数据。48h后，从培养箱中取出细胞放置在显微镜下观察所划直线宽度变化，并拍照，在同一放大倍数下测量直线宽度并做好记录作为24h数据。将实验组（100×10-6、75×10-6、50×10-6）0h数据与24h数据差值，分别和对照组（150×10-6）0h数据与24h数据差值对比。分析DDW对细胞的侵袭能力影响差异是否有统计学意义。
????????1.5流式细胞术检测细胞周期
????????按实验“1.3”项下方法收集Hela细胞以1×105个细胞/mL的密度接种于直径为6cm的培养皿中，分别加入含10%FBS的普通1640培养基（150×10-6，对照组）或不同氘浓度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640培养基（实验组）培养24h，用0.25%不含EDTA的胰酶消化并收集细胞。用70%乙醇固定，4℃过夜，PBS清洗1次，1000r/min离心5min，弃上清；PBS再清洗1次，1000r/min离心5min，弃上清；每管加入500μL染色液（500μLPBS+2.5μLPI+2μLRNaseA），37℃水浴避光染色30min，经60目尼龙网筛过滤，立即用流式细胞仪分析。计数1×104个细胞，观察细胞周期各期的分布特征。
????????1.6Westernblot法检测Hela细胞p21蛋白的表达水平
????????按实验“1.3”项下方法收集Hela细胞并计数，以1×105个细胞/mL的密度接种于直径6cm培养皿中，分别加入含10%FBS的普通1640培养基（150×10-6，对照组）或含不同氘浓度（100×10-6、75×10-6、50×10-6）的1640培养基（实验组）培养24h，弃培养基，PBS洗涤3次，加入细胞裂解液RIPA200μL裂解，并加入蛋白酶混合抑制剂20μL，置冰上30min让其充分裂解，细胞刮子收集细胞，4℃、10000r/min离心15min，吸取上清液分装置-80℃备用。NanoDrop微量紫外分光光度计测定蛋白含量，各孔的蛋白上样总量一致，均为100μg。电泳浓缩胶80V，50min，分离胶110V，150min。经过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，110V500mA转膜120min，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。采用室温含2.5%脱脂奶粉的PBST（400mLPBS+40μL吐温20）封闭60min，按抗体要求的比例加入兔抗p21一抗（1∶3000）、兔抗β-actin一抗（1∶3000），4℃过夜，室温复性1h，PBST洗膜4次，10min/次，按一定比例（1∶10000）加入相应的AlexaFlour800goatanti-rabbitlgG（H+L）二抗，室温避光孵育120min。PBST洗去未结合的二抗3次，10min/次，Westernblot红外荧光显像仪显影。
????????1.7免疫组织化学LP法检测p21、Na+/K+-ATPase蛋白表达变化
????????按实验“1.3”项下方法将Hela细胞消化后，分别在6孔板中每孔平行加入6×105个细胞。用普通含10%FBS1640普通培养基（150×10-6）及低氘浓度（50×10-6）的1640培养基进行培养24h后，除去培养基，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶，10%正常羊血清孵育，滴加一抗4℃孵育过夜，PBS缓冲液（Na2HPO48.1mmol/L，KH2PO41.5mmol/L，NaCl137mmol/L，2.7mmol/L，pH7.4）振荡清洗后分别滴加二、三抗，DAB显色，苏木精复染。阳性信号呈棕色细颗粒状。
????????1.8统计学方法
????????采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
????????2结果
????????2.1低氘水对Hela细胞增殖的影响
????????含氘浓度为100×10-6、75×10-6、50×10-6的培养基培养24h对Hela细胞的抑制率分别为16.01%、26.17%和33.39%，48h的抑制率分别为7.98%、25.27%和34.5%，72h的抑制率分别为11.42%、21.46%和39.54%。各实验组与对照组比较差异均有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表1。
????????表1低氘水对Hela细胞增殖的影响（x±s，n=6）
????????注：与对照组比较，P<0.05，P<0.01
????????2.2低氘水对Hela细胞迁移侵袭能力的影响
????????含100×10-6、75×10-6、50×10-6DDW的培养基（实验组）培养48h对Hela细胞的迁移侵袭能力有抑制作用，与对照组（150×10-6）相比，75×10-6、50×10-6DDW的抑制作用较为明显（P<0.01）。见图1。
????????P<0.05，P<0.01
????????图1低氘水对细胞迁移侵袭能力的影响
????????2.3低氘水对Hela细胞周期的影响
????????从图2可以看出，DDW对宫颈癌Hela细胞周期具有抑制作用，随着培养基中氘浓度的降低，Hela细胞主要表现为G1、G2期静止或略微增加，S期逐渐降低；其中，氘浓度为75、50ppm的抑制作用较为明显，S期明显减少（P<0.01），见表2。
????????表2各组Hela细胞周期情况（%，x±s，n=3）
????????注：与对照组比较，P<0.05，P<0.01
????????2.4低氘水对p21蛋白的表达的影响
????????分别用含氘浓度100×10-6、75×10-6、50×10-61640培养基（实验组）和氘浓度150×10-6的正常1640培养基（对照组）处理Hela细胞24h后，Westernblot法检测发现DDW能够明显上调宫颈癌Hela细胞中p21蛋白的表达（图3）。Hela细胞中p21蛋白在氘浓度为100、75、50ppm的培养基（实验组）中表达灰度值分别为（0.717±0.037）、（0.979±0.082）、（1.146±0.087），与对照组（0.539±0.042）比较，差异有统计学意义（P<0.05）。
????????P<0.05，P<0.01
????????图3Westernblot法检测p21蛋白的表达
????????2.5低氘水对p21、Na+/K+-ATPase蛋白表达的影响
????????分别用氘浓度为150×10-6普通1640培养基和氘浓度为50×10-6的1640培养基处理Hela细胞24h后，免疫组化检测p21、Na+/K+-ATPase蛋白表达变化。从图4中可以看出，经过染色后可以发现p21蛋白在氘浓度为50×10-6的1640培养基中的表达明显高于氘浓度为150×10-6正常1640培养基；而Na+/K+-ATPase在氘浓度为50×10-6的1640培养基中的表达明显低于氘浓度为150×10-6正常1640培养基。
????????3讨论
????????在前期研究中发现，DDW可以抑制肺癌、鼻咽癌和肝癌肿瘤细胞的生长以及在延长癌症患者生存期方面具有积极的作用[19-23]。然而目前尚未见低氘水对宫颈癌的作用研究的相关报道。本研究将Hela细胞用不同DDW浓度的培养基处理，用MTT法、划痕实验观察到随着培养基中氘浓度下降，Hela细胞的增殖和侵袭转移能力得到明显的抑制，在氘浓度为50×10-6的培养基，72h的增殖抑制率达到39.54%（P<0.01）。划痕实验发现，DDW对宫颈癌细胞的侵袭能力具有抑制作用，同样在50×10-6时差异性最明显（P<0.01）。Westernblot和免疫组化检测相关蛋白的表达情况，发现DDW能选择性上调Hela细胞中p21蛋白的表达水平，下调Na+/K+-ATPase的表达。p21waf基因是p53基因重要的下游基因之一，其表达产物p21蛋白是目前已知的具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期抑制蛋白。p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站。因DNA损伤后不经过修复则无法通过G1检查站，减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用。Sultana等[24]研究发现，宫颈癌患者对化疗的敏感性是通过p53-Bax调节通路，诱导细胞凋亡而起作用；先期化疗可以促进宫颈癌患者CD8+和CD4+阳性的T细胞、自然杀伤细胞诱导产生干扰素γ，通过免疫系统而起作用。Gy？觟ngyi等[25]证实，DDW能降低经致癌源处理大鼠C-myc、Ha-ras和p53基因表达。本研究用流式细胞术检测含不同氘浓度的培养基对Hela细胞周期的影响。随着DDW氘浓度的降低，主要表现为G1、G2期逐渐增加，S期逐渐减少。这很可能是DDW选择性抑制Hela宫颈癌细胞株增殖和转移能力的分子机制之一，即通过p53介导，有效上调p21影响细胞的周期进程和凋亡，从而达到对肿瘤细胞的抑制作用。Na+/K+-ATPase是肿瘤组织异常增生的物质基础之一，与正常细胞相比，肿瘤细胞内的Na+/K+-ATPase活性是显著升高的。李春晓等[26]及Usta等[27]研究表明，抑制Na+/K+-ATPase活力可作为一种新的治疗乳腺癌和肝癌的有效手段。本研究Westernblot和免疫组化结果显示，经DDW处理的Hela细胞，Na+/K+-ATPase蛋白明显下调。这些结果说明，降低细胞生长环境中的氘体积浓度，可以抑制Hela宫颈癌细胞株的增殖和转移能力，DDW具有选择性抗肿瘤的靶向生物效应。
????????人类乳头状瘤病毒（HPV）和吸烟是宫颈癌的两大危险因素，HPV感染是最主要的因素，几乎所有的宫颈癌都与HPV感染有关[28]。宫颈癌的主要治疗手段是手术、放射治疗和化学药物治疗。手术治疗主要适用于早期宫颈癌（ⅠA～ⅡA期）患者。虽然传统上认为，宫颈癌对化疗药物不敏感，治疗方法以手术和放疗为主，但是大量的肿瘤细胞学研究进展和临床实践证实，对于亚临床和微小的转移灶手术和放疗并不能完全控制和消除。因此，作为治疗癌症有效方法之一的化疗在宫颈癌的综合治疗中的地位也越来越受到重视。近年来，研究表明，癌细胞增长机制与氘原子有很大的关系，通过降低体内氘的浓度，可以抑制体内癌细胞的增长。因此，DDW作为新型无毒副作用抗癌辅助治疗剂在肿瘤治疗中将具有重要应用前景。
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????????（收稿日期：2013-12-03本文编辑：程铭）
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