羽毛RNA提取方法羽毛组织样品采集：1.RNA样品采集相关耗材准备：手术剪，镊子，RNAZap，DEPC水配制的75%酒精2.首先对环境布置
并简易去除RNase。（用75%酒精和RNAZap）3.选取growingfeather（见下图1），快速放入将组织放入盛有1m
LTrizol的玻璃Telfon管（见下图2）。RNA提取实验准备工作：1.试剂的准备：Trizol、氯仿、异戊醇、75%乙醇（D
EPC处理过水配制）、无水乙醇、DEPC水。2.仪器的准备：冷冻离心机（提前开好机器，把温度调到4C）、1.5ml无RNase离心
管、枪（100ul、1000ul）。3.正式提取前，对超净台先用75%乙醇进行处理，然后用RNAZap处理。所用仪器也用RNAza
p进行处理。常用实验操作流程--分离RNA将组织放入盛有1mLTrizol的玻璃Telfon管（见下图2）中，上下反复匀浆，破碎组
织。（该组织液可存放于-80度冰柜一个月）注意：前期采样过程要用75%的酒精，RNAzap喷洒羽毛和剪刀镊子，破碎组织过程全程在冰
上进行，该过程比较重要。2.将上述匀浆液吸出到1.5ml无RNase离心管，于室温静置5分钟。3.加0.2ml氯仿到匀浆液上方，盖
上管盖；剧烈震荡15秒（使用振荡器），室温（15-30度）静置2-3分钟。4.4度12,000xg离心样品15分钟。（液体分层
为淡红色苯酚/氯仿混合液，中间层，无色上清液（从底部到顶部）。RNA在无色上清液中，此后步骤RNA都极易降解）5.打开管盖，45
度角倾斜离心管，把上清液转移到新管中，如果分离DNA和蛋白质可保留底层苯酚/氯仿混合液。6.加0.5ml100%的异丙醇，轻柔上
下翻转15次，室温静置10分钟。7.4度12,000xg离心10分钟。8.离心后在管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清。9.加1m
l75%乙醇洗涤RNA沉淀（轻柔上下翻转5次）。10.室温7500xg离心5分钟，弃上清。室温放置干燥10分钟。11.加30
ulDEPC处理的水溶解RNA。12.电泳检测RNA质量（标准电泳图见图3），Nanodrop测定浓度（做好记录）。预防RNas
e污染注意事项：1.经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌、霉菌可能成为RNase的来源。2.使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交
叉污染。3.RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻
璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料制品可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。4.
配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01℅v/v，放置过夜，高压灭菌（
注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作）。图1图2图3提取RNA中所用各种试剂的作
用：1.TRIZOL：裂解细胞，能保存RNA的完整性。2.氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无
机相迅速分离。DNA提取过程有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋
白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性作用，剧烈的震荡，很容易使得DNA的亲水基
团，与水相接触。所以不要剧烈震荡。氯仿的作用有多个方面，一是作为有机溶剂变性蛋白，使其沉淀并通过离心除去，同时也通过变性作用抑制R
Nase活性；二是RNA提取试剂中通常含有苯酚，苯酚微溶于水，抽提完之后水相里有痕量的酚，如果不除去会损伤核酸，需要通过氯仿把水相
里参与的苯酚抽提掉；三是作为溶剂抽提样品中的一些脂溶性杂质（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除杂作用，常氯仿里面会加少量异戊醇（
1/25），减少蛋白质在变性过程中由于震荡产生的泡沫，影响后续操作。3.异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA或者DNA链
中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。异丙醇是沉淀核酸用的。4.酒精可以溶解一些沉淀中可能的有机物杂质,二是洗掉异丙醇,氯仿试剂,酒精的易挥发性。 |
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