LncRNA引物设计-十年资深qPCR引物设计经验分享及常用LncRNA数据库介绍LncRNA的qPCR引物如何设计？在设计的时候有没有需
要特别注意的地方？如何能设计出最好的qPCR引物。基于这些问题，总结自己10年qPCR引物设计经验分享给大家。LncRNA的qPC
R引物相比于编码基因，是要复杂。导致其复杂的原因并不是引物设计原则上有特别之处，而是在于有太多的LncRNA数据库，数据库之间往往
没有关联，且不同数据库的维护也不尽相同。今天的文章分两块：LncRNA数据库介绍和LncRNA引物设计注意事项。LncRNA数据库
介绍1、NCBIRefSeqNCBI不多做介绍，通常LncRNA信息我们参考RefSeq数据库中的数据，RefSeq数据库中的数
据参考数据，是经过人工审核，其数据信息可信，注释全面。RefSeq数据库中LncRNA的命名通常是NR_或者XR_开头，后面加数字
，其外显子信息位置，数量信息非常完整。2、Ensembl相同的LncRNA，Ensembl数据库中信息往往要比NCBI多很多，特别
是转录本数量。且数据变化非常快且变化会很大，可能昨天浏览这个数据库中某个LncRNA只有2个转录本，隔天再去看的时候，可能就变成3
个甚至更多。NCBI就不同，尽管更新频率也非常的快，但是LncRNA的变化通常很小，转录本数量基本不变化，序列变化的可能性也非常的
小。3、UCSCUCSC数据库的LncRNA数据个人认为更新相对较慢，但有些LncRNA名称如uc001ylu就需要前往UCSC数
据库查询其序列信息。UCSCGenomeBrowser可以根据基因组的位置、基因ID、转录本等信息进行浏览查询。4、RNAce
ntralRNAcentral整合了包括Ensembl、GENCODE、Greengenes、HGNC、LNCipedia、l
ncRNAdb、miRbase、NONCODE、RDP、RefSeq、Rfam、SILVA在内的多个数据库。5、NONCODEN
ONCODE是一款综合性的数据库，该数据库是一个比较全面的ncRNA相关注释的数据库，尤其是lncRNA信息，不仅支持常用lncR
NA的Name、NONCODEGeneID（例如：NONHSAG036681.2）搜索，部分lncRNA支持其他数据库名字进行
搜索。该数据库目前收入了很多物种，主要是动物方面的，包括人、小鼠、大鼠、奶牛、鸡、果蝇、斑马鱼、线虫、酵母、拟南芥、黑猩猩、大猩猩
、恒河猴、复鼠、鸭嘴兽、猩猩。数据库包含信息丰富，包括表达、功能、与疾病关系、染色体位置、序列保守性等，并可进行序列Blast搜索
，同时支持数据下载。6、LncipediaLNCipedia数据库整合了多个人类（Human）LncRNA数据库信息，很大程度上解
决了LncRNA数据库各自为政的问题，这些数据库包括LncRNAdb、BroadInstitute、Ensembl、Gencod
e、Refseq、NONCODE、FANTOM，同时还包括Nielsen,Hangauer等多篇文献中发现的LncRNA信息。目
前已经更新到5.2版本，包括127,802转录本序列和56,946条基因。7、Lncrnadb该数据库可以查询类似LINC0
0066,NCRNA00066名称的LncRNA。lncRNAdb数据库是一个真核生物的lncRNA综合数据库。它包括特异的序列
结构信息，如转录本、基因组位置、表达、亚细胞定位和保守位点以及相关的功能和疾病。数据库介绍总结：前面提到LncRNA的qPCR引物
设计相比与编码基因确实要难，其原因就体现在LncRNA的数据库是在太多，而我们设计得到的qPCR引物通常都需要进行引物特异性比对，
最好用的莫过于NCBIPrimer-Blast，但是在特异性比对可供选择的比对数据库都只是NCBI，其他LncRNA数据库无法选
择。接下来，小编就分享下非NCBIRefSeq来源的LncRNA的qPCR引物设计应该怎么做？LncRNA的qPCR引物设计注
意事项LncRNA的qPCR引物设计最主要的三个原则：跨外显子设计，特异性比对，引物位置。1、跨外显子设计跨外显子设计的目的就是避
免基因组的污染，跨外显子设计有两种办法，具体见示意图：（1）正向F引物和反向R引物落在不同的外显子上此处注意：（a）如果产物大小允
许，正向F引物和反向R引物可以落在不同的外显子上；（b）如果正向F引物和反向R引物只能落在两个相邻的外显子上，那优先选择内含子最大
的两个外显子上。（2）正向引物或者反向引物跨了两个外显子此处注意：（a）如果能选择（1）就不要选择（2）方法设计，（2）设计方法引
物位置受限，设计得到的引物参数可能不是最优。（b）如果选择（2）方法设计，那跨两个外显子的引物的3端序列不要跨第二个外显子太多序列
，建议不要超过6个碱基，否则就相当于没有跨外显子设计。2、特异性比对从上述数据库中查到LncRNA的序列信息后，建议先使用NCBI
进行比对，简单做一个核苷酸比对和基因组比对。核苷酸比对的目的是看看这条LncRNA有没有与NCBIRefSeq同源性较高的序列信
息。如果有，可能涉及到需要判断他们是否是同一条基因的问题。基因组比对的目的是简单判断其外显子个数组成，因为有些LncRNA数据库可
能没有提供外显子数量信息和外显子位置信息。比对其实就是一个不同数据库之间LncRNA信息的转换，当统一后，那LncRNA引物设计就
容易许多。3、引物位置引物尽量不要落在LncRNA序列两端100bp序列以内，原因是防止两端序列不准确。曾经碰到一个老师，自己使用RACE验证Ensembl数据库中的LncRNA序列，发现两端序列有缺失。4、同源区设计本人设计qPCR引物通常都选择在同源区设计，检测其总RNA情况，具体根据各自实验要求而定。这里不多做展开介绍。 |
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