（3）类风湿性关节炎的治疗类风湿性关节炎(RA)是一个系统性疾病，以关节滑膜慢性炎症反应为特征并有软骨变性和关节旁骨的侵蚀。（三）
融合蛋白技术的关键一般来说，3-5个氨基酸的Linker可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段
有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。（三）融合
蛋白技术的关键但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式，从中优化出理想的连接方式。另
外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。（三）融合蛋白技术的关键遗憾的是，目前对于连接肽序
列的设计还没有可靠的选择标准。现在，大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产
生了重大的进步，但是我们对于序列和结构之间的关系的了解还是很有限的。三、融合蛋白技术的临床
应用DNA疫苗双功能酶（多功能酶）定向药物溶栓剂抗菌肽（一）DNA疫苗
目前，疫苗已经经历了三代：第一代疫苗是用减毒或杀死的病原体来激活机体免疫系统；第二代疫苗是用生物技术和重组DNA技
术研制的组分疫苗注射机体诱导免疫应答；第三代疫苗是直接注射基因重组的抗原基因来激活人体免疫系统，即DNA疫苗。
（一）DNA疫苗DNA疫苗与传统疫苗相比有着明显的优势，如易于生产，稳定性强，成本低廉等，并可同时诱导体液与细胞免疫应答。
（一）DNA疫苗DNA疫苗的免疫方法是将带有目的基因并能在真核细胞中表达的细菌质粒直接导入动物体内，通过在体内表达
目的蛋白以引起机体对该蛋白的免疫应答。（一）DNA疫苗目前利用基因工程成功制成的多价重组抗体融合蛋白CYF1
96(国内尚未上市)就是一种DNA疫苗，它能有效防治下呼吸道感染和哮喘。因为CYF196对病毒的主要受体-位于呼吸道上皮中的细胞
间黏附分子有高度亲和力，对鼻病毒感染有较强的防御功能。（二）双功能酶（多功能酶）以往研究发现，
在利用基因融合所构建的大的酶分子中，如果用以构成融合蛋白的各个酶分子的整个编码序列均保留于新的酶分子中，则融合蛋白一般均保留所构
成的酶分子各自的酶活性。（二）双功能酶（多功能酶）并且发现在这些新构建的融合蛋白中，蛋白的正确折叠以及各个酶
的活性部位均未受到影响，与单个酶相比，融合蛋白的酶的比活力为50%-100%，对于催化连续反应的两种或几种酶，利用基因融合的方法
构成的融合蛋白可产生“邻近效应”（proximityeffect）。（二）双功能酶（多功能酶）目前研究发现，β-半乳
糖苷酶-半乳糖脱氢酶融合蛋白在一定条件下，其偶联反应产生NADH的速度是同时加入这两种酶的反应速度的两倍以上。同时过渡态时间缩
短近四倍。（三）定向药物定向药物一般由两部分组成：一部分是药物；另一部分是可以与病灶特异性结合的配基。通过融合蛋白技术将这两部
分融合在一起，即可构成一个具有独特构象与功能的蛋白质。（三）定向药物特点：它可以特异性地与靶细胞或致病因子结合，并把药物引导
至病灶处，从而大大提高药物的效力。可以选择性地杀伤相应的抗原相关细胞或受体相关细胞，对其他无关细胞影响较少或无影响。（三）定向药
物配基常是肿瘤特异性抗体、细胞因子或激素等导向物质，药物常是毒性分子（如动植物毒素、放疗、化疗药物或细菌毒素等）。（四）溶
栓剂新型溶栓剂的要求是具有多种功能，既有较高的溶栓活性，又有较强的纤维蛋白的亲和性或抑制血栓的功能，从而使溶栓剂具有较高的纤维蛋
白专一性，减少出血副作用，降低溶栓药物使用后再栓塞形成的可能性。（四）溶栓剂凝血酶在血小板激活后促进纤维蛋白酶原转化为纤
维蛋白，在凝血过程中起主要作用，在动物模型和人体中，肝素是凝血酶间接抑制剂，水蛭素则是其直接抑制剂。单克隆抗体mAb59D能靶向血
块，mAb59D8与纤溶酶原活化因子偶合能达到靶向治疗和有效溶栓的目的。（四）溶栓剂但两者化学结合不仅产量低，而且在生产过程
中部分损失了水蛭素的溶栓活性。利用基因融合技术，把水蛭素和mAb59D8的纤维蛋白原片段融合，融合蛋白在稳态时无作用，只有用凝血
酶原激酶(Ax)对它进行切割激活后，才有活性。（四）溶栓剂利用分子克隆技术，这种融合蛋白能成功转录并高效表达于mAb59D
8杂交瘤细胞系，这种策略结合了靶向溶栓和Ax因子激活，有效地在血栓处发挥作用，对全身的副作用很小。（五）抗菌肽肽类抗生素
又名抗菌肽，机体天然产生的抗菌肽由于其对耐药菌的强大抗菌作用而受到人们关注。它广泛存在于动植物体内，是由生物体特定基因编码的一类阳
离子小分子多肽，具有广谱抗菌活性，是机体天然免疫的重要组成部分。（五）抗菌肽研究结果表明，抗菌肽可以在亚毒性浓度下抑制HIV
-1的基因表达，减少HIV-1的增殖。而人源溶菌酶除了具有一般溶菌酶的抗菌活性外，也具有抗病毒的特性，已有研究证实人源溶菌
酶具有抗HIV-1的作用。（五）抗菌肽目前已有人构建了抗菌肽B和人溶菌酶的融合蛋白表达载体。并成功表达出了具有抗菌和抗病毒双重
活性的重组蛋白。四、常见的几种融合蛋白（一）免疫球蛋白（Ig）融合
蛋白（二）甲状旁腺激素（PTH）融合蛋白
（三）细胞因子重组融合蛋白（一）免疫球蛋白（Ig）融合蛋白Ig融合蛋白是指在基因水平将目的基因同Ig部分片段基因
相连，并在真核或原核细胞中表达出的具有上述两部分结构域的重组蛋白。据目的蛋白与Ig不同片断相连，可将其分为二大类：一类为Fab(
Fv)融合蛋白；另一类为Fc融合蛋白。1、Fab(Fv)融合蛋Fab(Fv)融合蛋白主要是将Fab(Fv)段与
其他生物活性蛋白结合，利用抗体对抗原的特异识别功能将活性蛋白导向特定部位。使活性蛋白在特定部位发挥生物作用。常见的与Fab融合的
蛋白有毒素、细胞因子、受体、酶等。肿瘤靶向免疫治疗将一些生物活性蛋白(如毒素、细胞因子等)与抗肿瘤抗体的Fab段融合，
利用抗体对肿瘤抗原的识别作用而进行靶向免疫治疗。肿瘤靶向免疫治疗如ForsbergG等利用抗癌胚抗原(CEA)抗体的Fa
b段与葡萄球菌肠毒素(SEA)融合组成一个超抗原，融合超抗原可导向肿瘤细胞并激活T细胞杀死表达有癌胚抗原肿瘤细胞。肿瘤
靶向免疫治疗而将T细胞共刺激分子B7与抗瘤抗体结合就可将B7导向肿瘤细胞。B7-抗瘤抗体，一方面与肿瘤细胞表面抗原结合，一方面提
供共刺激信号给T细胞能有效触发肿瘤特异细胞毒T细胞反应。2、Fc融合蛋白Fc融合蛋白主要是将生物活性蛋白与Ig的绞链区及
CH2、CH3区结合。与Fc段融合的蛋白种类很多，其作用也各不相同，归纳起来有如下几方面：（1）抗病毒感染目前发现使用DNA
疫苗加上IL-2-Ig融合蛋白注射到实验用的恒河猴，然后高剂量静脉内给恒河猴注射SHIV病毒。虽然它们不能阻止猴被SHI
V病毒感染，但确实可控制病毒血症到几乎测不到的水平，并预防免疫缺陷和临床症状。（1）抗病毒感染目前IL-2已用于临床治疗HI
V和癌症，但由于IL-2在活体内半衰期短，有毒性作用及成本高，其临床治疗作用受限。而用IL2-Ig融合蛋白，它有IL-2的
免疫刺激活性且半衰期长，用它注入健康恒河猴可诱导T细胞数目增加并表达CD25。（2）治疗痛觉过敏Etanercept，
一个重组TNFR-Fc融合蛋白，可竞争性抑制TNF，它已成功用于治疗类风湿性关节炎的病人，能减少疼痛和炎症，在神经损伤后，由
于局部产生前炎性细胞因子对疼痛产生起一个主要作用。给坐骨神经慢性压缩性损伤的鼠注射Etanercept可减少热痛觉过敏和机械
性异常性疼痛。（2）治疗痛觉过敏实验诱导猪神经根损伤，同时给猪注射Etanercept7天后显示Etanercept
能预防神经传导速度的减低，限制神经纤维损伤，防止毛细血管内血栓和神经内水肿形成。预示Etanercept可用于治疗椎间
盘突出和坐骨神经痛。融合蛋白及其应用主要内容融合蛋白的概念融合蛋白技术概况融合蛋白技术的临床应用常见的几种融合蛋白
一、融合蛋白的概念在基因工程迅速发展的基础上，有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起，进而表达所需
蛋白，这种通过在人工条件下将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白(fus
ionprotein，FP)。二、融合蛋白技术概况融合蛋白技术是为获得大量标准融合蛋白而进行的有目的
性的基因融合和蛋白表达方法。利用融合蛋白技术，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。（一）融合蛋白技术的特点融合基因可在原
核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得
到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。（一）融合蛋白技术的特点真
核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，
成本低。（二）融合蛋白技术的内容构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基
因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有：1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，
利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。（二）融合蛋白技术的内容2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并
回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。（二）融合蛋白技术的内容3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。（三）融合蛋白技术的关键在构建融合蛋白中，一个关键的问题是两蛋白间的接头序列(Linker)，即连接肽。它的长度对蛋白质的折叠和稳定性非常重要。如果接头序列太短，可能影响两蛋白高级结构的折叠，从而相互干扰；如果接头序列太长，又涉及免疫原性的问题，因为接头序列本身就是新的抗原。 |
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