Cre-lox系统介绍及使用汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率高的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有力工具。利用Cre-lo
x系统，可以在特定细胞、组织或整个生物体，甚至在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和
人类疾病动物模型的建立都具有深刻影响。1.什么是Cre-lox系统？从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：(1)Cre重组酶环
化重组酶（Cre,cyclizationrecombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之一，能催化两个DNA识别位点之间的
位点特异性重组。Cre重组酶来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。除Cre以外，此类重组酶还有Flp
（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。(2)Lox位点Cre重组酶识别的回文DNA位点，也叫loxP(locusof
X-overP1)位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT
。两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发生位置，这也决定了loxP的方向。N表示可变碱基，不同的
碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野生型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox
位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发生重组。在同一个DNA分子上，根据Lox位点的位置与方向
，可能会发生3种不同的重组事件：（1）切除：当两个Lox位点在同一染色体上且方向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫
Lox侧翼序列，Flox序列）。（2）反转：当两个Lox位点位于同一染色体上且方向相反时，两个Lox位点之间的序列发生序列反转，即
颠倒。（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染色体上且方向相同，则易位事件将导致DNA片段的交换。2.体内Cre-lox系统的基
础应用利用Cre-lox系统在小鼠体内实现对基因的时空特异性打靶（表达或敲除），原则上需要建立两种小鼠。首先，建立特异性Cre小鼠
，该小鼠中的Cre重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织或全身表达Cre重组酶。Cre重组的特异性由驱动Cre的启动子或增强子
控制。其次，需要建立Flox小鼠，即在该小鼠靶基因序列侧翼带有Lox位点。将上述两种小鼠杂交繁育，子代中可以获得既带有Cre又带有
Flox基因的小鼠，即条件性基因打靶（表达或敲除靶基因）小鼠。(1)条件性基因表达在小鼠中，Cre-lox系统最初被用于在特定细
胞群中打开基因的表达。条件性基因表达所需要的Flox小鼠，一般带有一个沉默的转基因，也就是说在靶基因与启动子之间有一个“终止盒”（
lox-stop-lox）。这个“终止盒”通常由强polyA信号和/或剪接供体序列构成，能阻止转基因的转录。这些Flox小鼠与细胞
类型特异性表达Cre的转基因小鼠交配后获得的子代小鼠中，在每个表达Cre重组酶的细胞中，终止盒被Cre切除，因此仅在这些细胞中表达
所需的转基因。(2)条件性基因敲除条件性基因敲除所需要的Flox小鼠，一般在需要切除的DNA片段两侧带有同方向的两个Lox位点（l
ox-GENE-lox）。与细胞类型特异性Cre小鼠交配后，Cre重组酶会识别Lox位点，导致靶基因被敲除。由于Cre基因的
表达受上游启动子的调控，因此启动子的时空特异性就决定了基因重组的时空特异性。在基因工程应用中最常见的是第一种重组方式，即Cre诱导
的loxP间序列删除。以制备条件型敲除小鼠模型为例，为实现某基因的条件型敲除，需要在目标基因（或基因的部分重要片段）两侧插入方向相
同的loxP位点，这种携带loxP位点但目标基因可以正常表达的小鼠称为“flox”小鼠。要实现“条件型”敲除，还需Cre重组酶参与
，通常是制作各种表达Cre重组酶的工具鼠，并将特定的Cre工具鼠与flox小鼠交配，获得同时携带loxP位点及Cre重组酶的双阳性
小鼠，即条件型敲除模型。在表达Cre重组酶的区域，删除靶基因（flox基因）两个loxP位点之间的部分，实现条件型敲除。通过某特定
基因启动子调控Cre重组酶，或与控制Cre表达的其他诱导系统相结合，使其在某特定的组织或条件下表达，可实现对表达时间和空间的调控3
.更精准的诱导型Cre-lox系统为了能够更准确地进行遗传功能研究，时间特异性的Cre-lox（也叫诱导型Cre-lox）被开发出
来，可用于研究生物体发育过程特定阶段的基因功能，或用来进行谱系示踪等。常用诱导型Cre-lox系统有：(1)CreER系统也叫他莫
昔芬（Tam）诱导的Cre系统。将Cre与雌激素受体ER融合，可通过他莫昔芬（Tam）诱导Cre的重组活性。在没有他莫昔芬的情况下
，CreER融合蛋白与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中（图5.1）。给予他莫昔芬药物处理会破坏HSP90与Cr
eER的相互作用（图5.2）。ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位（图5.3）。在细胞核中，CreER识别loxP位点（图5.
4）并使组织X中的基因Y失活（图5.5）。CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一般优选使用CreERT2。很明显，选择
合适的启动子调控Cre重组酶的表达决定着基因敲除的时空特异性，不同启动子驱动Cre表达从而实现在不同条件下的基因敲除，这些启动子可
以是细胞类型特异的，如Tek（内皮细胞）、Lyz2（髓样细胞）、Cd19（B淋巴细胞）、aP2（脂肪组织）、Nestin（中枢及周
围神经系统）和Alb（肝脏）等。使用这类Cre工具鼠搭配靶基因flox小鼠，可以实现靶基因在特定细胞中的敲除。除了这些特异性的启动
子外，也有更为广谱的驱动基因全身性表达的启动子，如：CAG、CMV、PGK、ACTB等。利用这类Cre工具鼠，可实现靶基因的广谱敲
除。有文献报导，PGK、ACTB和CMV启动子活性显著低于CAG[2]。当使用CAG驱动Cre诱导ES细胞中的loxP位点特异性重
组时，获得了最大的重组率，然后依次是PGK和MC1启动子[3]。CMV启动子在一些细胞类型（例如，293T和CMMT）中非常强，而
在一些细胞类型中非常弱（例如，MRC5和MSC）[4]，这也限制了它的应用。CAG启动子是常用的在哺乳动物表达载体中驱动高水平基因
表达的强合成启动子[5,6]。CAG启动子由以下原件组成：“C”，巨细胞病毒（CMV）增强子元件（thecytomegalovi
rus(CMV)earlyenhancerelement）；“A”，鸡β-肌动蛋白基因的启动子（thepromoter,
thefirstexonandthefirstintronofchickenbeta-actingene）；
“G”，兔β-珠蛋白基因的剪接受体（thespliceacceptoroftherabbitbeta-globing
ene）[7,8]。整个组成原件通常被称为“CAG启动子”，但它实际上包括了外显子、内含子和增强子等元件，是一个复合转录启动元件。
这些不同来源的原件，赋予了CAG启动子比其他广谱启动子更为广谱和稳定的特点，使其成为越来越多的真核表达载体及转基因载体选用的启动元
件。还有一些生殖细胞特异的启动子驱动Cre，也能实现全身性诱导loxP重组，如：Zp3-Cre、Ddx4-Cre、Prm1-Cre
等，它们可以在生殖细胞中表达Cre重组酶，通过与条件型敲除小鼠配繁，双阳性子代小鼠可在其生殖细胞中特异性删除loxP间序列，这样的
小鼠再配繁后获得的下一代可获得全身性敲除的可用小鼠，但它们需要比使用CAG-Cre这类广谱工具鼠多一代繁育时间（~3个月）。殊途同
归，在一些情况下，比如，正好找不到合适的广谱Cre时，这类生殖细胞特异的Cre也是较好的选择。基因敲除的时空特异性也可以通过某些外
源性化学物质来调控Cre的表达，如他莫昔芬（Tamoxifen）诱导系统和Tet-on四环素调节系统等，当与携带flox序列小鼠配
繁时可产生由Tamoxifen或Dox（四环素类药物）诱导的Cre介导的靶向删除。诱导性的基因敲除可避免在胚胎发育早期由于基因功能
缺失而导致小鼠死亡或畸形。(2)Cre;Tet系统四环素诱导系统，也叫强力霉素（Dox，四环素衍生物）诱导的Cre系统。该系统有两
种模式：Tet-on和Tet-off，分别是Dox依赖性Cre的激活和Dox依赖性Cre的失活。Tet系统包括以下元件：反向四环素
控制反式激活因子（rtTA）；四环素控制反式激活因子（tTA）；四环素响应元件（TRE），通常是19个核苷酸的四环素操纵子（tet
O）序列的7个重复，调节Cre基因的表达。Dox通常在小鼠的饲料或饮水中进行给药。(3)Cre;Tet-on系统在Tet-on系统
中，表达普遍存在的或组织特异性的启动子驱动的rtTA。在没有Dox的情况下，失活的rtTA无法与负责调控Cre基因的TRE序列结合
，则Cre不表达。在Dox给药之后，Dox结合并激活rtTA。激活的rtTA与TRE序列结合并诱导Cre表达。(4)Cre;Tet
-off系统另一方面，在Tet-off系统中，在没有Dox的情况下，激活的tTA能够结合Cre前的TRE序列并诱导Cre表达。而在
Dox给药后，与Dox相互作用的tTA被灭活。灭活的rTA不再与TRE结合，因此Cre表达受到抑制。4.Cre-lox系统的常见问
题(1)Cre小鼠的建立方法对Cre表达的影响早期Cre小鼠的建立主要通过随机转基因的方式，将外源特异性启动子连同Cre基因序列随
机地整合到小鼠基因组中。这些随机转基因方法虽然可以筛选到细胞特异性表达的Cre小鼠品系，但是由于Cre整合的随机位点和基因拷贝数的
不可控，Cre重组酶的表达很可能会受到染色体状态的影响，如DNA甲基化导致Cre的沉默。因此，更为可靠的方法是通过基因打靶（ES细
胞同源重组或CRISPR/Cas9途径）的方式将单拷贝的Cre基因定点整合到内源基因座中，受内源基因表达调控。这样一般有以下3种做
法：（1）Cre表达框直接插入到内源基因起始密码子前；（2）Cre连接在2A自剪切序列之后，插入到内源基因终止密码子位置；（3）C
re连接在内部核糖体进入位点（IRES）之后，插入到内源基因终止密码子之后。第一种做法:在表达Cre重组酶的同时会破坏内源基因的表
达。有些基因的杂合子和纯合子表达基因量不同导致下游信号强度差异。第二种做法IRES介导的翻译通常会导致Cre的表达强度衰减。此外，
应尽可能避免破坏内源基因3‘UTR，防止影响表达后修饰。因此，在建立新的Cre小鼠时，测试并记录新Cre小鼠中Cre的表达模式是非
常有必要的。5.如何测试一个新的Cre小鼠品系通常我们会利用Reporter小鼠与Cre小鼠杂交来验证Cre的表达谱。Report
er小鼠一般是在Rosa26位点插入带有lox-stop-lox终止盒以及报告基因（LSL-R）的一种工具小鼠，只有Cre酶介导重
组切除终止盒后，才会有报告基因的表达。例如需要验证GeneX-Cre定点整合小鼠，可将Cre杂合子小鼠（GeneXCre/wt）与
Reporter杂合子（Reporter?lox/wt）或纯合子（Reporterlox/lox）小鼠交配，通过免疫组化、免疫荧光
或原位杂交来判断Cre阳性的子代小鼠(GeneXCre/wt?;Reporter?lox/wt)报告基因是否在已知表达GeneX
的细胞中表达，从而了解Cre的特异性表达是否与预期的一致。6.影响Cre对lox位点重组效率的因素Cre重组酶的重组效率并不是10
0%的，也就是说当Cre小鼠与flox小鼠交配后，特定组织中只有部分细胞中发生重组，因此会产生嵌合模式。lox位点的放置位置会影响
重组效率。只有两个lox位点相遇才能在Cre作用下发生位点特异性重组，而两个lox位点相距越远，它们相遇的概率就越低，导致重组效率
也就越低。因此，在设计条件性基因打靶策略时，需要考虑基因结构与flox区域的长度，来降低重组失败的风险。Cre的表达量并不等同于C
re对lox位点的重组效率。很多时候由于基因组调控的复杂性，以及每个基因在不同细胞内染色质状态不同，Cre对于不同基因位点的Lox
p切割效率并不一致。甚至有可能会出现同一种Cre小鼠对一种flox基因起作用，对另一种flox基因则不起作用的极端情况。而在使用R
eporter小鼠指示Cre活性时，由于Reporter小鼠中lox位点与报告基因所在的基因组状态偏开放，从而使得Cre在Repo
rter小鼠中重组的效率会比对实际目标lox位点的重组效率要高一些。因此，Reporter小鼠验证的结果可以作为一种参考，但不是金
标准。可以用多种不同的Reporter小鼠来检测Cre小鼠的特异性重组,反映出Cre重组酶对不同基因的重组效率可能是不同的。Cre
重组酶的意外表达使用细胞特异性启动子控制Cre的表达可实现目标基因的选择性失活、激活或突变。通常我们希望Cre重组酶受启动子限制，
仅在小鼠的部分细胞中发挥重组作用。但Cre的意外表达，或被称为“异位”表达仍时常发生，这些异位表达可能会导致一些我们不希望发生的重
组。因此在建立Cre小鼠时选择谱系标志基因很重要。高特异性的谱系标志基因能高效精确地表达Cre，降低Cre漏表达或异位表达的概率。
应尽量避免使用那些高表达但非特异的标志基因来构建Cre小鼠。在使用Reporter小鼠验证组织特异性GeneX-Cre小鼠时，由于
对GeneX本身表达谱的研究并不详尽，GeneX可能在生殖细胞或早期胚胎发育过程中存在瞬时表达，因此常常会发现报告基因的表达比预期
的更为广泛。想要明确是否发生了生殖系中的Cre意外表达，可以通过将不同性别的子代小鼠(GeneXCre/wt;Reporterlo
x/wt)分别与野生型小鼠交配获得第二代。如果这些二代小鼠中报告基因的表达较第一代子代更为广泛，那么很有可能发生了Cre的生殖系表
达。因为Cre介导的重组可能发生在配子形成的二倍体阶段，发生重组后的单倍体子细胞发育成胚胎，导致第二代子代小鼠即使没有Cre基因的
整合，仍表达报告基因。如果Cre小鼠发生了生殖系表达，那么在应用该Cre小鼠进行条件性基因打靶时，需要谨慎选择Cre小鼠的性别与交
配方式以及对照组。比如，母系遗传的Cre小鼠品系，需要使用雄性带有Cre整合的小鼠进行繁殖；而父系遗传的Cre品系，则需要用雌性C
re阳性小鼠来繁育。当然，也可以通过使用诱导型Cre小鼠解决Cre生殖系意外表达的问题，实现仅在成年或胚胎发育晚期激活Cre重组活
性，获得条件性基因打靶小鼠。8.条件性基因敲除小鼠的繁育策略要获得条件性基因敲除小鼠至少需要两步遗传杂交。第一步，将GeneX-C
re杂合子小鼠与GeneY-flox杂合或纯合子小鼠交配，获得的Cre与flox双阳性（GeneX?Cre/wt;GeneY?l
ox/wt）子代小鼠。第二步，将Cre与flox双阳性（GeneX?Cre/wt;GeneY?lox/wt）子代小鼠再与GeneY
-flox杂合或纯合子小鼠交配，获得所需的GeneX?Cre/wt;GeneY?lox/lox小鼠为实验组。一般对照组为同窝Ge
neXwt/wt;GeneY?lox/lox小鼠。如果Cre的整合破坏内源基因，那么应选择GeneX?Cre/wt;GeneY?
wt/wt小鼠作为对照。在进行基因型鉴定的时候，不仅要对小鼠鼠尾进行基因鉴定，对特异性目标组织也需要进行基因型检测。这时需要设计P
CR引物方便区分野生型等位基因、flox等位基因和重组后的KO等位基因。在鼠尾鉴定时，如果发现重组后的KO产物，那么需要考虑该组织特异性Cre小鼠的生殖系表达问题。之后需要检测重组后靶基因的mRNA和蛋白表达，来验证Cre-lox系统的工作效果。根据靶基因与lox位点的位置，可以设计qPCR模板或者探针来检测重组后的靶基因转录情况。进一步可以通过免疫组化检测条件性基因敲除后靶基因蛋白翻译是否缺失或异常。不过这很大程度上依赖于探针或抗体的灵敏度和特异性。9.Cre-LoxP系统在转基因小鼠上的应用策略Cre-LoxP位点特异重组酶系统现阶段已经发展为体内外进行遗传操作的一个有力工具。该系统在转基因小鼠上的应用，可使靶基因的特异性表达某种蛋白。在神经科学领域，结合AAV病毒可以在一定时间空间范围内特异性操纵某一类型神经元，应用甚广。这些基于重组的策略可能对基因功能的研究和人类疾病的动物模型的建立产生深刻影响。参考:?南模生物贝赛模式a小博集萃药康 |
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