2020肠道类器官在炎症性肠病研究中的作用与进展（完整版）
摘要
IBD与遗传易感、免疫失调、肠上皮机械屏障破损、肠道微生态失调和环境因素刺激五大因素相关。肠上皮构成的体内与体外机械屏障破损作为IBD发病机制的五大因素之一，又与其他四大因素相互关联；肠上皮修复、黏膜愈合是IBD治疗的目标。肠上皮在IBD的发病和治疗中均有重要作用。2009年，源自富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5阳性肠道干细胞的肠道类器官3D培养系统诞生，为IBD肠上皮的研究提供了良好的体外模型。现阐述肠道类器官的起源，并总结该技术在IBD研究中的应用与进展。
IBD是一种慢性、免疫性、肠道溃疡性疾病，其发病与遗传易感、免疫失调、肠上皮机械屏障破损、肠道微生态失调和环境因素刺激五大因素相关。肠上皮构成的体内与体外机械屏障，不仅直接面对共生菌、致病菌和食物抗原等环境因素，也可通过直接接触或经各种细胞因子介导与肠上皮内固有层免疫细胞相互作用；此外，遗传因素亦可影响肠上皮细胞（intestinalepithelialcell，IEC）功能。肠上皮机械屏障破损作为IBD发病机制的五大因素之一，与其他四大因素相互关联，在IBD发病过程中发挥重要作用。肠黏膜完全再生，即黏膜愈合，是IBD治疗的目标，且黏膜愈合有助于维持IBD患者的长期缓解，降低手术风险。肠上皮在IBD的发病和治疗中均有重要作用，值得研究者关注。
然而，IEC目前无法在体外稳定培养、传代，阻碍了对IBD患者IEC的研究。用于研究的IEC多起源于肿瘤细胞，与体内IEC具有诸多不同之处，代表性欠佳。2009年，一项重大技术——源自富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（leucine-richrepeat-containingGprotein-coupledreceptor5，Lgr5）阳性（Lgr5＋）肠道干细胞（intestinalstemcell，ISC）的肠道类器官3D培养系统诞生，为IBD肠上皮的研究提供了可行、可信的体外模型。现就肠道类器官的起源和该技术诞生10年以来在IBD研究中的应用与进展进行综述。
ISC与肠上皮的形成
小肠上皮层由隐窝和绒毛构成，目前认为隐窝基底柱状细胞（cryptbasecolumnarcell，CBC）和＋4位干细胞均为小肠ISC，两者能相互转化。不同之处为CBC位于隐窝底部潘氏细胞之间；生理条件下可持续分裂，小肠上皮层约5d更新1次；Wnt信号可刺激CBC增殖，Lgr5作为Wnt信号通路的靶基因之一，可标记CBC；此外，亦有研究发现Wnt信号通路靶基因无刚毛鳞甲样蛋白2（achaetescute-like2，ASCL2）和Y染色体性别决定基因相关的高速泳动蛋白家族基因9（sexdeterminationregionofYchromosomerelatedhighmobilitygroup-boxgene9，SOX9），以及抗凋亡分子嗅质蛋白4（olfactomedin-4，Olfm4）和Musashi-1（Msi1）等可特异性标记Lgr5＋CBC。
而＋4位干细胞位于最顶部潘氏细胞之上，在生理条件下相对静止，当Lgr5＋ISC损伤时，＋4位干细胞大量增殖并参与肠上皮修复，但对Wnt信号无反应。过去曾认为B细胞特异性莫洛尼氏白血病病毒插入位点1（B-cellspecificmoloneymurineleukemiavirusinsertionsite1，BMI-1；与干细胞自我更新能力相关）、端粒酶反转录酶（telomerasereversetranscriptase，TERT；调节干细胞增殖）、同源域特有蛋白X（homeodomain-onlyproteinX，HOPX；与肠上皮隐窝高表达β半乳糖苷酶相关）和多亮氨酸重复区免疫球蛋白样结构域1（leucine-richrepeatimmunoglobulinlikedomain1，LRIG；负性调控表皮生长因子信号）可标记＋4位干细胞，但也有研究显示以上4个基因亦可在Lgr5＋CBC中表达。
Lgr5＋CBC每24h分裂1次，成为短暂扩充细胞，短暂扩充细胞再分化为各种IEC，并沿绒毛两翼向绒毛顶部移动，最后在绒毛顶部凋亡脱落。分化后的IEC包括吸收细胞、多种分泌系细胞和派尔集合淋巴结中的M细胞。3种重要的分泌系细胞包括分泌激素的内分泌细胞，产生黏液的杯状细胞和隐窝中的潘氏细胞。
结肠上皮无绒毛结构，无潘氏细胞，但具有行使相同功能的c-Kit阳性分泌细胞。结肠ISC为Lgr5＋CBC，而无＋4位干细胞，其余细胞组成与小肠基本相同。Lgr5＋CBC是目前最为研究者所接受的ISC。
肠道类器官的起源
2009年Sato等分离小鼠小肠上皮隐窝后，使用独特的无血清培养环境，以基底膜基质、表皮生长因子、骨形态发生蛋白信号通路抑制头蛋白和Wnt通路激动剂R-脊椎蛋白为环境因子，建立了小鼠小肠类器官3D培养系统。小肠类器官3D培养系统可以在体外建立肠上皮组织，其中包含了除间充质细胞和免疫细胞外所有的IEC，如ISC、潘氏细胞、杯状细胞、神经内分泌细胞和吸收细胞，这些不同种类细胞的位置与体内分布情况一致，并且均保持了相应的功能。小鼠结肠或人肠道类器官培养条件与小鼠小肠有所不同。肠道类器官分化成熟后，可通过出芽方式形成更多的类器官，并可持续传代培养一定时间，且其基因组保持稳定。
以小肠类器官为例介绍Lgr5＋CBC来源肠道类器官的形成过程。隐窝上皮分离后呈发夹样开放，数小时至1d后自动闭合，形成1个由多种小肠上皮细胞构成的上皮细胞囊样结构，被称为肠道类器官球形结构（enterospheres），其中心具有单个的内腔，内含凋亡的上皮细胞；隐窝分离培养2～3d后肠道类器官球形结构形成出芽结构，并向外萌出数个隐窝，演变形成1种具有多个隐窝单一内腔的结构，称为小肠类器官，形成小肠类器官需3～7d。
此后，又有2种肠道类器官的培养方法被报道。2011年Spence等报道了应用多能干细胞（pluripotentstemcell，PSC）或胚胎干细胞形成人肠道类器官。PSC可在一定条件下先后分化为包含内胚层的细胞、后肠、人肠道类器官，人肠道类器官虽具有隐窝-绒毛结构，但仍不成熟，缺乏成人肠上皮的某些特征。与Lgr5＋CBC来源肠道类器官不同的是，人肠道类器官不仅有上皮细胞，还有间充质细胞，包括成纤维细胞和平滑肌细胞。
2017年Miura和Suzuki报道了应用直接再生技术将分化的体细胞转化为肠道类器官。将小鼠胚胎成纤维细胞转化为诱导的胎儿肠源性祖细胞（inducedfetalintestine-derivedprogenitorcell，iFIPC），iFIPC可形成球形类器官，在不添加Wnt通路激动剂的条件下传代，球形类器官可发育形成出芽类器官。人脐静脉内皮细胞可转化为iFIPC，再生成球形类器官，但人iFIPC来源的球形类器官不能形成出芽类器官。
肠道类器官作为IBD研究
体外模型的优势
肠道类器官可保持其隐窝来源的特性，应用于IBD研究的体外模型具有较高的代表性和可信度。肠道类器官的细胞组成、排列方式与肠上皮结构类似，在培养皿连续传代培养至少8个月，仍可保持其隐窝特性。肠道类器官具有与其隐窝来源一致的染色体数和类似的表达谱。来源于小肠或结直肠的类器官可特征性地表达小肠或结直肠标志物；UC患者肠道类器官转录组中表达上调或下调的基因与肠黏膜活组织检查标本有较高的一致性。Noben等发现类器官中IL-1β和γ干扰素转录水平低于其来源黏膜活组织检查标本，认为黏膜标本炎性因子水平并不会延续至类器官中，这些炎性因子的过表达需要再施予适当的刺激。
肠道类器官的体外培养所需组织量少，利用内镜下黏膜活组织检查标本或手术标本均可，且肠道炎症部位或非炎症部位黏膜均具有体外形成肠道类器官的能力。体外培养形成肠道类器官周期短，约1周可由分离的隐窝ISC增殖、分化形成类器官。这种类器官可以冷冻保存或传代培养。以上这些特征均有助于肠道类器官在IBD体外研究中的应用，并有助于建立患者来源类器官的生物样本库，可用于筛选有效药物，实现个体化治疗。
综上所述，肠道类器官可保留其来源隐窝特性，容易在短周期内获得，并可长期保存，以上特征使其成为应用于IBD研究的可行、可信的体外模型。
肠道类器官在IBD研究中的应用
1．IBD慢性并发症研究：
IBD慢性并发症如肠道纤维化、癌变等，对患者生命质量和生存期构成严重威胁，但是针对这些慢性并发症尚无有效的药物治疗方案，患者常需行手术治疗，这是IBD研究亟待攻克的难题之一。肠道类器官培养成功后，可建立IBD慢性并发症的体外模型，进行机制和治疗药物筛查研究。
2017年Hahn等从小鼠小肠、结肠分离隐窝培养为肠道类器官，先施予TNF-α刺激，之后给予TGF-β1刺激，两者协同作用促使肠道类器官发生IEC-间充质细胞转化，为研究IBD肠道纤维化提供了便捷、有效的体外模型。
2017年Hibiya等从小鼠结肠分离隐窝并培养为结肠类器官，将细胞因子（TNF-α100ng/mL、IL-1β10ng/mL、IL-610ng/mL）和细菌成分（细菌脂多糖100ng/mL、鞭毛蛋白100ng/mL）的混合物隔日加入类器官培养基中，持续干预1年以上，以模拟慢性炎症刺激用于研究炎-癌转化机制。结果发现结肠类器官在慢性炎症刺激后，NF-κB信号通路持续激活，细胞分化障碍，并发生可能与UC癌变相关的细胞转化。
2．肠黏膜损伤、修复相关的研究：
IEC损伤导致肠黏膜屏障破坏，肠道有害病原体、食物抗原通过破损的肠黏膜屏障与上皮间或固有层免疫细胞接触，激活免疫反应；药物治疗或可促进肠上皮再生，实现黏膜愈合。已有研究将肠道类器官与免疫细胞或细胞因子共培养，在IEC的损伤、修复机制方面有了新的发现，有利于认识IBD患者肠道炎症发展过程中肠道病理变化并寻找新的药物干预的靶点。
IBD被认为主要经T淋巴细胞介导，CD患者在急性炎症过程中，黏膜活组织检查病理常可见潘氏细胞化生，2018年Biton等应用小肠类器官，阐明了Th及其炎性因子对Lgr5＋ISC再生或分化的影响。该研究发现表达主要组织相容性复合体Ⅱ（majorhistocompatibilitycomplexⅡ，MHCⅡ）的Lgr5＋ISC是一种非典型的抗原提呈细胞，其通过MHCⅡ与Th相互作用，Th1、Th2、Th17及其分泌的促炎因子γ干扰素、IL-13、IL-17A促进Lgr5＋ISC分化，而调节性T细胞（T-regulatorycell，Treg）及其分泌的细胞因子（IL-10）促进Lgr5＋ISC再生。
有研究发现予回肠类器官IL-22短期干预后，ISC再生能力和类器官形成率均降低；但短暂扩充祖细胞的数量增加，并向各类上皮细胞分化，使形成的类器官体积增大。从而推测在肠上皮急性损伤中，IL-22有助于短暂扩充祖细胞向各类上皮的分化，促进肠上皮修复；在肠上皮慢性损伤过程中，IL-22可能因导致ISC损伤而不利于上皮再生、修复。应用IL-22促进IBD患者黏膜修复时，应关注其对ISC的长期慢性损伤。
3．IBD与肠道微生态的研究：
IBD患者肠道菌群多样性和丰度下降，短链脂肪酸生成减少，以及肠道微生态失调及其与宿主之间的相互作用是近年来IBD研究的热点。类器官亦可用于研究肠道微生物（益生菌或病原菌）的菌体成分、代谢产物或活菌与肠道上皮之间的相互作用，有助于阐明IBD固有免疫失调与肠道微生态的关系，用于治疗IBD的肠道益生菌对维持或恢复肠上皮稳态的作用机制，以及短链脂肪酸对肠黏膜屏障的影响等问题。Hou等建立了乳杆菌、小肠类器官、肠固有层淋巴细胞共培养系统，发现乳杆菌可通过促进肠道固有层淋巴细胞分泌IL-22，从而促进TNF-α刺激后肠道类器官肠上皮的增生与修复。
肠道微生物以专性厌氧菌为主，而IEC系在20%氧浓度下培养，对氧条件需求的矛盾阻碍了肠道厌氧菌与肠上皮相互作用的体外研究。类器官具有密封的管腔和黏液层，可模拟体内肠道氧气梯度，为研究厌氧菌与肠上皮相互作用提供了更合适的体外模型。目前亦有研究利用起源于Lgr5＋CBC的结肠类器官探讨艰难梭状芽孢杆菌的致病机制，但尚鲜见文献报道该模型中厌氧菌的活力。
4．IBD遗传学研究：
IBD更常见的是多基因变异，共同导致个体对IBD遗传易感，其中部分基因变异显示与上皮功能相关，肠道类器官为这类IBD的研究提供了良好的体外模型。此外，亦有罕见的早发型IBD（如发生于5岁以下儿童的极早发IBD）可为单基因变异所致，但由于较罕见，更难进行大规模研究更困难，而类器官可传代、冻存并保持遗传物质稳定性，为探索IBD中的遗传-表型关系、药物筛选等研究的开展提供了足够且遗传稳定的实验材料。
有学者发现CD患者末段回肠上皮细胞DNA甲基化特征与UC或健康人不同，起源于CD患者末段回肠ISC的类器官仍保留其起源隐窝DNA甲基化的特征，对IBD不同分型的鉴别有一定意义。
5．IBD的治疗研究：
人结肠类器官可用于评估药物对体外UC模型中IEC修复的治疗效果，实现个体化治疗，即对体外培养IBD患者肠道类器官给予细胞因子、脂多糖等混合因子刺激，可建立肠道类器官炎症模型。通过观察药物干预后肠道类器官的生长情况，以及检测所含细胞增殖与分化、屏障功能或基因表达情况，有助于体外评估新药疗效。人结肠类器官较传统的IEC系更具代表性，可有望应用于干细胞移植治疗以期更新破损黏膜，达到黏膜愈合的治疗目标。但体内环境和调控复杂，不能完全代表患者体内对药物的反应。研究表明这些体外培养的肠道类器官可通过肛门植入体内重建受损上皮层。当这些类器官移植至右旋葡聚糖硫酸钠小鼠结肠炎模型中时，可显著改善右旋葡聚糖硫酸钠致结肠炎的临床活动度评分，并且供体细胞可准确靶向定植于结肠炎诱导的溃疡面，开始重构、修复隐窝结构。这些结果表明ISC移植可能为IBD患者提供临床获益的治疗新方案。
然而，类器官移植治疗IBD仍存在较多问题。首先，需评估其安全性，ISC体外培养能否使这些细胞易于发展形成肿瘤？供体肠黏膜中可能存在哪种病原体？在类器官移植时，需对供体黏膜携带的病原体进行全面调查。其次，如何将培养的类器官靶向传递至目标区域，并且保证类器官在病变黏膜处保留足够修复受损黏膜的时间也是需解决的技术问题。最后，还需要通过前瞻性临床研究验证ISC移植的临床效果。
肠道类器官应用的局限性
肠道类器官的临床应用和未来前景令人鼓舞，但亦有一定局限性。肠道类器官的构成仅包含IEC，无免疫细胞、神经细胞或血管组织，虽然接近体内组织结构，但仍不能完全模拟体内肠上皮及其微环境。不同实验室培养类器官条件存在差异，可能造成实验结果不一致，其培养技术需进一步优化和标准化。炎症部位的肠上皮组织由于上皮层损失或侵蚀，肠隐窝的数量和质量可能下降而不足以实现体外增殖、分化并衍生出肠道类器官，可考虑应用来自炎症相对轻的部位的肠黏膜组织以克服这个问题。开发可靠的微生物群-上皮细胞相互作用模型仍存在挑战，肠道厌氧菌与好氧细胞共培养的条件和技术有待更多的研究探索。在转化医学中使用类器官时应考虑IBD患者的复杂性和生物学异质性。
小结
起源于人体Lgr5＋CBC的肠道类器官因其相对容易获得，培养周期短，可保留起源隐窝特征，可传代、冻存并保持遗传稳定，是IBD体外研究的理想肠上皮模型，可用于研究IBD慢性并发症、肠上皮损伤和修复、肠道微生态、遗传学机制、药物筛选等。未来的研究将进一步揭示IEC调节IBD的病理生理学机制，这有助于针对黏膜愈合开发新型IBD治疗药物。通过基于ISC移植治疗的研究有望使IBD的治疗获得新的进步，这种疗法不仅有望诱导和维持缓解，并且可能通过"刷新"患者黏膜而降低癌变风险。然而，在肠道类器官用于IBD研究和治疗时，仍有待讨论和解决较多的技术、安全和伦理问题。
|
|
