食管腺癌来源的胞外小泡MicroRNAs在胃器官类中诱导肿瘤表型摘要：目前还没有关于癌细胞衍生的胞外囊泡(ev)对三维类器官的影响的报告。在
这项研究中，我们描述了食管腺癌(EAC)来源的ev对胃类器官(gastroids)的初步作用，并阐明了这些作用的分子机制。PKH-
67染色鉴定EVs。在与食管腺癌衍生的细胞外囊泡共培养的胃类器官，我们测定了形态学变化、Ki-67免疫化学、细胞存活率、生长速率以
及miR-25和miR-210及其靶mrna的表达水平。c-ev被胃类器官有效地吸收。值得注意的是，经c-ev处理的胃类器官
更加拥挤、紧凑、多层且包含更小的腔相比于单独在有机培养基或eac条件培养基中ev已被耗尽的。此外，c-ev处理的胃肠道表现出增加
的增殖和细胞活力相对于培养基或ev耗尽的对照组。c-ev处理组的miR-25和miR-210表达水平明显高于对照组，PTEN和A
IFM3表达水平明显低于对照组。miR-25和miR-210的抑制剂通过降低miR-25和miR-210的水平，逆转了c-外泌体在
共培养胃类器官中诱导的细胞增殖增加。综上所述，我们构建了一种新的cEVs与三维胃体共培养的模型体系。利用这个模型，我们发现癌源性E
Vs在胃肠道中诱导肿瘤表型。这些变化至少部分归因于miR-25和miR-210的EV转移。介绍类器官目前被定义为来自于器官特异性组
织生长的多能干细胞的三维结构，这些多能干细胞通过自我更新和腱鞘分化[1]进行自我组织。到目前为止，已成功建立了小鼠肠道[2]、肝脏
[3]、胰腺[4]、结肠[5]和前列腺的类细胞器[6,7]，而人类小肠、结肠[5]、胃[8]和前列腺的类细胞器[6,7]。这
些类器官可以长期培养，并基于[7]全基因组测序与它们的患者组织来源相似，提示它们具有稳定的表型和遗传特征。以前，研究人员使用细胞系
和异种移植研究胃肠道(GI)肿瘤;然而，这些先前的模型是有缺陷的，因为细胞系是不朽的，而异种移植物有器官类型的特性。相比之下，胃肠
道组织来源的类器官具有细胞类型特异性特征，可用于模拟器官发生、感染和恶性肿瘤，以及药物疗效和毒性研究[9-12]。细胞外囊泡(Ex
tracellularvesicles,EVs)是由多种细胞在正常和病理条件下分泌的[13,14]。一种EV是外泌体，它起源于
多泡小体与质膜[15]的融合，其直径在30-150nm之间。微泡，或“外质体”，是另一种EV类型，大小从50到2000纳米;这
些结构直接从细胞的质膜[16]芽。第三种EV包括凋亡小体，体积较大，大小在1~4mm之间。凋亡小体在细胞程序性死亡后期发生凋亡
膜起泡时被释放。在目前的研究中，我们使用0.22-水柱m过滤器从食管腺癌(EAC)细胞的条件培养基中分离出ev;因此，我们提取的e
v主要由外泌体和一些微泡组成。ev由富含蛋白质、脂质和核酸的复杂结构组成，包括信使rna(mRNAs)、microRNAs(m
iRNAs)和DNA[18]。mirna是一种小的非编码核苷酸，长度约为18-23个核苷酸，广泛存在于真核细胞中。MiRNAs
通过降解或抑制靶mRNA转录本的翻译来调节细胞的增殖、分化和凋亡，从而抑制靶基因[19]的表达。MiRNAs参与胚胎发育、正常代谢
和许多人类疾病，包括肿瘤发生[20]。在本研究中，我们重点研究了EVmiRNAs作为EV功能的潜在递质。EV的膜结构可以阻止血清
或其他体液中的酶降解EV货物中的蛋白质或核酸分子:因此，它们已被考虑用于生物标志物的开发。此外，由于其稳定性，它们是细胞间通讯的重
要介质，通过自分泌或旁分泌机制[21]影响靶细胞并调节其功能，而这一机制也涉及到许多人类疾病[22,23]。许多科学家已经对细胞系
中的ev进行了研究[22,23]。相比之下，在目前的研究中，我们试图确定在共培养中介导ev与三维GI有机体相互作用的机制。据我们所
知，目前还没有报告描述这种特殊类型的互动。因此，我们建立并研究了一种基于EAC细胞与正常人胃上皮样组织(gastroids)共培养
的新型模型系统。此外，我们评估了这些ev在诱导胃肠道肿瘤表型上的作用。最后，我们评估了EV诱导的胃肠道肿瘤变化是否与EVmicr
oRNAs，特别是miR-25和miR-210的异常表达相关。材料和方法细胞培养及组成最终人类器官培养基OE33SKGT4
EAC细胞系,Het-1A正常食管上皮细胞,和人类L-Wnt3A和293年t-ha-rspo1-fc细胞获得美国类型文化收集在20
12年和2016年之间和认证由小型串联重复序列分析2013年和2017年之间。所有细胞系在解冻后培养不到2个月，使用前进行支原体检
测。我们制备了由wnt3a条件培养基(CM)、R-spondin1-CM、表皮生长因子(EGF)(Invitrogen)和其他
生长因子组成的人器官样培养基[2,5]。类器官培养基传代在约翰霍普金斯医院进行上消化道内窥镜检查时，我们获得了5个正常的人体胃组织
。所有患者都提供了书面知情同意协议，该协议由约翰霍普金斯大学医学院的机构审查委员会批准。正常胃粘膜的诊断是通过病理评估来确定的。我
们从正常的人胃上皮组织中培养并传代了胃类器官[5]。共培养时，我们将50微升(浓度1011/ml)的EVs加入到450微升的有机培
养基中，使终浓度为1010EVs/ml(c-EV组)。当胃类器官传代后，我们将20微升EVs与50微升crypt-Matrige
l悬浮液共培养，然后将70微升mol/l混合物分配到24孔板。最后，我们将平板放在37℃的培养箱中固化基质，然后将470微升(
含生长因子)的类器官培养基和30微升(ev)的ev加入到C-ev组的培养基中(共50微升)。我们还设置了对照组胃类器官，仅含5
00微升的类细胞质培养基(仅含培养基组)，以及第二个EV耗尽的[EV(?)]对照组，包括50°l的上清液(来自超离心去除的EV的E
AC-CM)+450微升的类细胞质培养基。EV的培养和鉴定EAC细胞培养48-72小时，达到85%以上confluent，收获
CM,400×g离心10min，清除细胞和碎片;SKGT4或OE33CM在4℃下以1:1的比例保存。从上清液中分离出ev，然
后对[24]进行超离心分离。利用纳米视线、纳米颗粒表征仪和纳米颗粒跟踪分析软件对电动汽车进行了实时分析。EVs的PKH-67染色使
用PKH-67荧光细胞连接试剂(Sigma-Aldrich,MO,USA)根据制造商的说明对ev进行标记，以跟踪其移动和位置。
为了确定体外胃肠道是否有效吸收ev，我们将pkh-67标记的ev或仅添加培养基(不添加EVs)到类器官培养基中。用激光激发pkh
-67标记的活体组织中的绿色荧光信号。我们在ZeissAXIO观察显微镜下观察ev的位置并获取图像。EV的传染根据BCA测定E
V转染量。首先，我们在超离心力作用后暂停了Opti-MEM的30倍流量。我们增加了2μl米尔抑制剂或消极的控制(炒米尔抑制剂组,1
0μMnd25μlOpti-MEM在管),放置1μlofRnMXnd25μlOpti-MEM管B,
混合250μlofresuspended液(Opti-MEM)管和管B的内容,然后保持为6小时37°C的孵化器。最后，我们再
次对ev进行超离心分离，用Opti-MEM中相同数量的PBS重悬，加入到类器官培养基中共培养。细胞活力评估用TrypLE表达(Th
ermoFisher)将胃类器官溶解消化成单细胞;在胃类器官治疗1天前，每组在每96孔板上分别计数3000个细胞。我们用有机介质
设置另一个孔作为空白对照;每组有5个重复孔。我们使用WST-1细胞活力检测试剂盒(罗氏，曼海姆，德国)根据制造商的说明将分散的类器
官的单细胞接种到96孔板(3000个细胞/100血盟/孔)上。RNA提取和芯片分析根据制造商的说明，使用总EVRNA和蛋白分离
试剂盒(ThermoScientific)提取EVRNA。对于胃类的总RNA，我们先在Trizol试剂(ThermoScie
ntific)中分离出微球，然后根据厂家说明使用RNeasyMini试剂盒(Qiagen)提取。采用HumanHT-12v4
表达芯片(Illumina,CA)进行芯片杂交。五百毫微克的总RNA的三组(500μl类器官培养基(介质仅组),50μl的上层
清液(从EAC-CM枯竭的超速离心法)+450μlof类器官培养基(EV(?)组、c-EV组]是放大和标签使用Illumin
a公司TotalPrepRNA扩增工具包(AMIL1791Ambion,TX)所描述的制造商的指示。采用RT引物和SYBR
GreenSupermix(Bio-Rad,CA,USA)进行两步实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)。内控基因为GAP
DH。使用引物为:PTEN,F:5’-gctacctgttaaagaatcatctgg3’，R:5’-CATGAACTT
GTCTTCCCGT-3’;AIFm3,F:5’-GCTCATTGTGGGTGCAGGTG-3’和R:5’-GGAC
GGTCGTAGGGAAGGTG-3’;GAPDH,F:5''-ggtatcgtggaaggactcatga-3
''和R:5''-ATGccagtgagcttcccgttcg-3''。对于microRNAs，使用逆转录试剂盒(Appli
edBiosystems)和TaqManmirna特异性引物(LifeTechnologies)合成cDNA。然后使用mir
na特异性cDNA进行相应的TaqManmirna特异性检测(检测id:miR-21:000397,miR-25:0004
03,miR-93:000432,miR-192:000491,miR-210:000512,RNU6B:001093,
LifeTechnologies)，并使用TaqMan通用PCRMasterMix。所有数据分析了根据2?ΔΔCtmeth
od。类器官免疫组化(IHC)用于类器官免疫组化染色，我们将类器官标本包埋在对甲醛固定的石蜡中，并切成1-4mm的切片。切片先脱
蜡后脱水。切片用一抗Ki67孵育(Ab16667,1:5000稀释;(英国Abcam)在4摄氏度过夜。PBS洗涤，用山羊抗小鼠
IgG(1:5000稀释)孵育;(PierceBiotechnology,Inc.，Rockford,IL,USA)在
室温下作为二抗使用60分钟。最后用二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB,Sigma,MO,USA)染色，苏木精反染，乙醇脱水。苏木精
、伊红(H&E)染色按厂家说明进行。切片由两名独立的病理学家阅读和标记，并在显微镜下获得图像。所有实验均独立重复至少三次。数据以平
均值±SEM表示。统计比较分析使用学生的t检验或单因素方差分析，与随后的事后多重比较。P.05的A值被认为具有统计学意义。所有检
验和P值均为双侧。采用SPSS20.0软件进行统计分析。结论EV的鉴定和eac衍生EVmirna的筛选首先，我们从EAC细胞
和正常食管上皮细胞(Het-1A)中分离出EVs。如[24]所述，我们使用nanosighttrackinganalysis(
图1A)和免疫印迹技术对EV标记蛋白(CD63)进行观察和识别。外泌体的平均大小为141±0.8nm;平均浓度为2.55×101
1/ml。在目前的报告中，从EAC细胞中提取的ev称为“c-ev”，而从Het-1A细胞中提取的ev称为“n-ev”。越来越
多的研究已经证实ev传递的miRNAs可以促进肿瘤进展和转移[25-27]。MiR-21、miR-25、miR-93、miR-19
2和miR-210是众所周知的常用研究的致癌miRs(oncomiRs)，它们也被作为几种人类癌症的生物标记物进行研究[28,2
9]。因此，我们通过qRT-PCR确定eac衍生的ev是否比Het-1A细胞含有更高水平的这5种onco-miRNAs;结果是如图
1B所示。与Het-1A组相比，EAC组中5种mirna的表达均显著增高。EVs的PKH-67染色和胃类器官摄取在将PKH-6
7标记的ev与胃体共培养48小时后，我们使用PKH-67染料观察了胃类器官摄取外泌体的情况。如图1C所示，用pkh-67标记的E
Vs培养的胃类器官显示绿色荧光;无EVs培养的pkh-67标记的胃类器官未见绿色荧光。这一发现表明，eac衍生的ev(c-e
v)被带进了胃类器官，甚至穿透了基质凝胶。与EVs共培养的胃类器官的形态学特征共培养6周后，仅培养基组(图2,A,D)或rE
V(?)组(图2,B,E)的胃类器官呈单薄层生长，腔大，管状结构大，有出芽;相比之下，C-ev组(图2,C,F)的胃类器官
更加拥挤，管腔更小，更致密，呈多层生长。这些结果与肿瘤形态[30]一致。胃类器官的Ki-67和H&E染色胃类器官与c-EV共培养6
周后，胃类器官的Ki-67和H&E染色，大部分为Ki-67阳性(图3C)，而仅培养基组(图3A)或EV(?)组(图3B)则相反。这
说明c-EVs促进了胃类器官的增殖。此外，仅培养基组(图3D)或EV(?)组(图3E)的H&E染色显示，每个样器中均有规则有序的单
细胞层，而在c-EV组中则可见不规则、多层、结构不一致的深染大细胞核(图3F)。这一发现表明，c-EVs在胃类器官中诱导肿瘤表型。
ev共培养的胃类器官WST-1细胞活力测定基于上述发现，我们使用WST-1细胞活力测定法定量测量细胞生长速率。如图4所示，与c-E
V共培养的胃类细胞存活率高于仅培养基和EV(?)组(P.05)。ev共培养胃类器官的整体基因表达测定为了获得c-EVs在胃类
器官中诱导肿瘤表型的潜在机制的线索，我们对mRNA和miRNA表达进行了微阵列检测。这些实验的代表性结果如表1所示。值得注意的是，
在c-EV组中，一些前microrna异常上调，而在仅培养基或EV(?)组中则相反。特别是，相对于中-EV组和EV(?)组，c-E
V组中miR-25和miR-210的上调最为显著(大于两倍)。这与我们之前的研究结果一致，在之前的研究中，我们证实miR-25和m
iR-210起源于EAC细胞[24]分离的EVs。这一发现表明，c-EV将miR-25和miR-210传递到胃类器官，而这些c-E
VmiRNAs有助于观察到的胃类形态学变化。因此，我们将重点放在这些mirna上进行进一步的实验。miR-25、miR-210及
其靶mrna在ev共培养胃类器官的表达水平为了证明外糖胞外源miRNAs通过其靶mrna对下游发挥作用，我们测量了分别以Targe
tscan、miRWalk和MicroRNA.org作为miR-25和miR-210靶基因PTEN和AIFM3的表达。如图5A所示
，c-ev处理的胃类器官，miR-25和miR-210水平显著升高(miR-25平均foldchange归一化至中值组，4.2
2±0.42,P.01;miR-210平均foldchange归一化到中值组，3.72±0.56,P.0.01)。而从图5
B可以看出，c-ev处理的胃类器官中PTEN和AIFM3的mRNA水平显著降低(PTEN归一化至仅培养基的平均foldchan
ge为0.58±0.08,Pb.01;AIFM3的平均foldchange归一化为中剂量组，0.62±0.12,P.0.
01)。PTEN和AIFM3是成熟的肿瘤抑制基因，其抑制作用已被证明有助于肿瘤的发生[31,32]。因此，这一发现提示了一种潜在的
分子机制，即在癌源性ev治疗后观察到的胃类器官表型的变化。抑制miR-25和miR-210逆转c-EV在共培养胃类器官中的增殖作用
为了进一步研究EV诱导的胃类器官增殖是否与EVmiR-25和-210有关，我们分别将miR-25或miR-210抑制剂转染到EV
中，然后与胃类器官共培养。本实验共分为四组:单独有胃类器官培养液组、c-EV组、c-EV+miR25/miR210抑制剂组、c
-EV+miR25/miR210超抑制剂组。然后对细胞进行WST-1检测和qRT-PCR。结果表明，miR-25和miR-21
0抑制剂都逆转了C-ev对胃类器官的增殖作用(图6,A和C分别)。此外，qRT-PCR显示，相对于未转染miR-25inhi
bitor或转染转染c-ev的c-ev,miR-25转染的c-ev中miR-25表达显著下降，PTEN表达增加(图6B);
同样，与未转染或干扰抑制剂转染的c-ev处理的胃类器官相比，与miR-210inhibitor转染的胃类相比，miR-210显
著下调和AIFM3显著上调(图6D)。这些结果表明，c-EV至少部分通过上调c-EVmiR-25和miR-210以及下调它们的靶
mrna来促进胃类器官细胞的增殖。结论虽然ev的确切生理功能仍有待阐明，但这些结构已被广泛认为是维持体内平衡的交流载体。越来越
多的证据表明，癌细胞来源的ev通过免疫抑制、微环境干扰、新生血管生成、转移等机制在肿瘤生长和进展中发挥重要作用[25-27]。例如
，Chowdhury等在3D共培养模型[33]中发现前列腺癌源性EVs通过激活TGF-beta信号通路，促进肿瘤增殖和侵袭性，使骨
髓间充质干细胞分化为癌相关的成纤维细胞样状态。同样，在Le等人的一项研究中，高转移性乳腺癌细胞将携带miR-200家族miRNAs
的ev传递给非转移性乳腺癌细胞，从而增强肺转移[34]。EV通过抑制miR-200靶基因，包括zeb2和sec23，在非转移性乳
腺癌细胞系和小鼠异种移植模型[34]中传递miR-200诱导间充质到上皮细胞的转变。基于这些发现和其他发现，一个逐渐形成的共识认为
，源自癌细胞的ev可使以前不具有这些特征的细胞或组织具有致瘤性和/或转移性表型。根据以上研究，我们发现与正常胃类器官培养的ev可以
促进其增殖，并诱导其出现肿瘤形态(图2-3)。EVs作为细胞间载体，在肿瘤与其微环境之间的沟通中发挥着重要作用:癌细胞通过传递
含有致癌因子的货物，影响和改变局部和远处的非恶性受体细胞的功能，从而促进肿瘤发生[27]。越来越多的证据已经证实，ev转移的miR
NAs是癌细胞通讯的关键介质，其复杂而强大的成分允许癌细胞改变其环境[35]。研究证实了来自脑瘤、转移性乳腺癌、黑素瘤[36]和肺
癌[37]的EVs水平递送miRNAs。在本研究中，我们关注EVmiRNAs作为与EV共培养诱导胃肠道肿瘤变化的重要分子机制。根
据我们的结果，EVmiRNAs中折叠变化最大的是miR-25和miR-210;因此，我们选择这些进行进一步的研究。MiR-25是
一种特征良好的oncomiR，广泛参与肿瘤的生长和转移[38,39]。多项研究表明，血浆miR-25水平可以作为胃癌患者预后不良的
生物标志物[40,41]。一个众所周知的miR-25靶基因，磷酸酶和紧张素同源物(PTEN)，通过下调高致瘤性PI3K/Akt信号
通路[42]来抑制肿瘤的发生。Feng等报道，miR-25敲低提高了肝癌干细胞的敏感性，通过PTEN/PI3K/Akt/Bad信
号[31]介导介导凋亡。此外，Zhang等证实了ev-transferfromastrocytemiRNAs通过抑制PTE
N[43]的表达促进了脑瘤细胞的转移。根据Zhang[43]的报道，我们发现c-EV处理的胃窦具有更大的增殖能力、miR-25的上
调和PTEN的下调，这表明EV可能促进胃内增生，至少部分是通过传递EVmiR-25，然后以PTEN为靶点(图5和6B)。Mi
R-210是另一种特征良好的onco-miRNA，它与人胃癌、结直肠癌和卵巢癌的上皮-间质转化相关[44-46]。Bigagli等
发现源自人HCT-8结肠癌细胞的外泌体miR-210促进了邻近转移细胞的粘附。AIFM3(凋亡诱导因子线粒体相关3)是一个与凋亡诱
导因子(AIF)[29]同源的基因。两项研究表明AIF可诱导[47]细胞凋亡。Yang等研究表明，下调miR-210可通过增加AI
FM3[48]的表达，诱导人肝癌细胞凋亡，提高辐射敏感性。同样地,我们发现c-EVgastroids展览治疗增生性活动增加,mi
r-210水平,增加和减少AIFM3水平相对于介质仅或EV(?)组(图5)。此外,mir-210的差别有对这些和AIFM3
upregulationgastroidsmir-210培养inhibitor-transfectedc-EVs相比gastroidsuntransfected处理或超抑制剂-转染c-EVs(图6d)。肿瘤的发生发展可以看作是细胞增殖和凋亡之间的不平衡。因此，我们推测EV可能通过抑制细胞凋亡来促进胃类器官肿瘤的改变，而细胞凋亡的抑制是通过EV传输miR-210抑制AIFM3来介导的。由于EV分离技术的局限性，由于缺乏特异性的EV物理和化学生物标记物，往往难以区分不同的EV类型;因此，研究人员仍然难以鉴别和识别癌细胞条件培养基中的功能成分或详细的EV载货元件(如蛋白质、脂质、mrna和mirna)[50]。我们仍有兴趣评估EVmrna、EV蛋白或其他EVoncomiRNAs是否影响人的GI类器官或引起形态学改变。综上所述，在本研究中，我们试图构建一种由eac衍生的ev与胃类共培养的新模型体系，并观察ev对胃类器官的作用及其机制。我们证明了我们可以建立一个模型之间的相互作用EVs和胃类器官;此外，我们发现c-EVs促进了胃类器官的增殖并诱导了肿瘤表型的改变。最后，我们发现EVmiR-25和miR-210至少部分介导了这些效应。结合已发表的文献，这些结果也表明c-ev可能是很有前途的消化道肿瘤生物标志物和潜在的治疗工具，尤其是miR-25和miR-210是胃癌诊断和治疗的潜在分子靶点。 |
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