农业生物技术精要（2019年）
朱常香授课
第一章绪论
1.农业生物技术的概念：生物技术又称生物工程，它是采用高科技手段对生物性状进行改良，培育高产、优质、抗逆新品种或利用生物体生产有价值的产品的技术。应用于农业领域的生物技术即农业生物技术。
2.生物技术诞生的标志：DNA重组技术、淋巴细胞杂交瘤技术
3.现代生物技术起始时间：20世纪70年代
4.农业生物技术的内容：
5.1983年，第一株转基因植物问世。
1981年，首次获得转基因小鼠。
第二章植物组织与细胞培养
第三章细胞工程与植物性状改良
第四章植物基因工程基本原理
2.多基因家族：起源于单基因，在植物进化中，通过基因的复制及放大而成为多基因家族,同一家族的基因成员具有高度的同源性。比如编码储存蛋白的基因、豆血红蛋白的基因等。
3.病毒启动子—CaMV35SPro。（花椰菜花叶病毒（CaMV）是一种双链DNA病毒.）
CaMV35SPromoter特点：
（1）不同于正常结构基因的启动子，可启动整个CaMV基因组（约8000bp）转录成RNA。
（2）启动作用较强，可在大多数植物细胞内启动基因的表达，并受植物细胞的调控。
（3）组成型表达。
4.启动子根据作用方式及功能可分为三类:
5.
6.cDNA文库：以mRNA为模板经反转录合成的DNA文库，代表了大多数mRNA的信息，其制备过程包括样品总RNA的分离，cDNA的合成，cDNA插入载体DNA分子，以及转化细菌繁殖保存等步骤。
7.基因组文库：以基因组DNA为材料制备的文库，代表整个基因组的DNA信息。其制备过程包括基因组DNA的分离，限制性内切酶，DNA片段插入载体DNA分子，以及转化细菌繁殖保存等步骤。
8.基因的分离的方法：DNA文库建立（cDNA文库、基因组文库）、PCR、RT-PCR、差异表达克隆、异源克隆、转座子标签法克隆、作图克隆
9.基因编码区的改造：
（1）密码子偏爱性:
a.细菌等原核生物三联密码子的第三位上偏爱A、U等，即NNU或NNA
b.植物密码子的第三位上大多偏爱G或C。
（2）外源基因mRNA的稳定性
10.基因的构建（了解）：
11.常用的选择标记和报导基因：
（1）选择标记基因主要是一些抗生素抗性基因或除草剂抗性基因
npt-II基因
②T-DNA:
a.携带的基因具有典型的真核生物类型的转录信号，如5’端TATA/CAAT盒，3’端polyA。
b.携带有致瘤基因（编码植物激素：生长素和细胞分裂素）。
c.至少含有一种编码合成稀有氨基酸（或衍生物）的基因，这种氨基酸只有农杆菌可利用，作为生长、繁殖所需的碳源和氮源。
③T-DNA的转化需要Vir区基因的表达和左右边界（LB、RB）的存在改造的后优点减少了Ti质粒的分子量；
除去了致瘤等有害基因，除去致瘤等有害基因的Ti质粒称之为“卸毒Ti质粒”(disarmedTiplasmid)；
有了单一酶切点，可插入目的基因，单一酶切点（多克隆位点）处于T-DNA两边界序列之间，因此可将插入的目的基因整合到植物基因组DNA内。
B.病毒介导法
（2）DNA直接导入法
13.转基因植物的分子分析
（1）核酸杂交分析（详见课件）
Southern杂交分析：
杂交程序:植物总DNA提取限制性内切酶酶切根据样品DNA和对照DAN杂交带谱的情况，可获得两种信息：
其一，证明目的基因是否已经导入并整合到植物基因组；
其二，目的基因的拷贝数及存在状态。
Northern杂交分析根据样品DNA和对照DAN杂交带谱的情况，可知：外源基因在转基因植株中是否进行了有效转录.
ELISA检测技术的基本A.直接法；B间接法；C双抗体夹心法
第五章基因工程与植物性状改良
直链淀粉改良脂肪酸组成的基因工程
b.降低饱和脂肪酸含量
2.基因工程改善光合碳代谢途径：
（1）提高CO2固定能力（C3、C4途径）
（2）降低光呼吸（光合效率降低25％）
（3）提高蔗糖和淀粉的合成速率
3.雄性不育基因工程（杂种优势）
?♂同花：三系配套（不育系、恢复系、保持系）
?♂异花：人工去雄（化学去雄）
利用基因工程创造不育系和保持系
b.反义RNA途径技术阻断与花粉发育有关基因表达
c.提早降解胼胝质壁途径（2）基因工程创造保持系的两种策略（了解）：
4.植物抗病机制5.基因对基因概念：
6.毒性基因
（1）已知产物的毒性基因：胞外水解酶、胞外多糖、毒素、植物激素
（2）未知产物的毒性基因：hrp基因、dsp基因
7.无毒基因
决定病原菌小种与含相应抗病基因的寄主植物表现专化性不亲和性（抗性）。无毒基因直接或间接编码的产物，是能在含有相应抗病基因的寄主植物上引起抗病反应的激发子，它是与抗病基因产物（受体）结合的配体。
玉米的Hm1基因：第一个被克隆的抗病基因，不符合基因对基因模式。
番茄的Pto基因：第一被克隆的符合基因对基因模式的植物抗病基因。
病毒基因的功能RNA沉默本质——转录后的基因沉默（PostTranscriptionalGeneSilencing,PTGS）细胞核内高速转录，细胞质内降解
RNA介导抗性的特征：
（2）抗性更持久
（3）抗性范围窄（多病毒片段重组转化——嵌合基因）
（4）非翻译RNA的应用，更安全
13.miRNA与siRNA的不同点（了解）：
（1）miRNA是内源的；而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入体内，是RNA干涉的中间产物。
（2）结构上，miRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。
（3）Dicer酶对二者的加工过程不同，miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。
（4）在作用位置上，miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
14.植物抗真菌基因工程
（1）抗真菌蛋白基因
核糖体灭活蛋白（RIP）基因概念及机制
15.植物抗细菌基因工程
（1）植物抗病基因
（2）降解致病毒素的基因
（3）杀（抗）菌肽基因
概念：杀（抗）菌肽是指昆虫体内分泌的一类存在于血淋巴中的碱稳定性蛋白。
机制：杀（抗）菌肽的抗菌活性依赖于其两亲性的α-螺旋结构。这种结构使之可以在原核细胞膜上形成巨大的时间性及电压依赖性的离子通道，致使细胞内外的渗透压改变，细胞内容物，尤其是K＋大量渗出，细菌因此死亡。
（4）溶菌酶基因
16.植物抗虫机制：
（1）物理防御机制
（2）化学防御机制
（3）另外抗病机制：蛋白酶抑制剂、外源凝集素
17.植物来源抗虫基因
（1）蛋白酶抑制剂基因（PI）
杀虫机理：
a.蛋白酶抑制剂与昆虫消化道内蛋白消化酶相结合，形成酶抑制剂复合物（EI），从而阻断或减弱蛋白酶对于外源蛋白质的水解作用，导致蛋白质不能被正常消化；
b.同时EI复合物能刺激昆虫过量分泌消化酶，这一作用使昆虫产生厌食反应。这样，昆虫由于缺乏生活代谢中所需的一些氨基酸，必然导致昆虫发育不正常或死亡。
c.此外，蛋白酶抑制剂分子可能通过消化道进入昆虫的血淋巴系统，从而严重干扰昆虫的蜕皮过程和免疫功能，以致昆虫不能正常发育。
种类：
a.丝氨酸蛋白酶抑制剂：
①豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）
一个抑制剂分子有两个抑制活性中心，可同时竞争性地抑制两个胰蛋白酶分子。
②马铃薯蛋白酶抑制剂（PI-1、PI-II）
马铃薯和番茄PI-I只有一个活性中心，主要抑制胰凝乳蛋白酶活性。
马铃薯和番茄PI-II有两个活性中心，可分别抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性。
b.巯基蛋白酶抑制剂
（2）α-淀粉酶抑制剂
（3）植物凝集素基因
18.Bt毒蛋白基因的杀虫机理：
（1）Bt毒蛋白在伴孢晶体内以原毒素（protoxin）形式存在，当被昆虫取食后，在昆虫中肠碱性和还原性环境下，毒蛋白溶解。
毒蛋白一经溶解，在蛋白酶作用下，通过专一性蛋白水解酶切割，原毒素被活化，转型为毒性多肽分子。
’端高度变异，3’高度保守，第100氨基酸处保守疏水跨膜序列
（2）动态性：同一苏云金杆菌株系同时含有几种Bt毒蛋白基因或同一Bt毒蛋白基因存在于不同苏云金杆株系中，这种现象称为Bt毒蛋白基因的动态性。
20.Bt毒蛋白基因的应用中存在问题：
（1）表达量低
（2）耐药性
策略：
（1）提高表达量：
a.短截Bt基因，使仅表达N端部分；并加一强启动子；
Bt基因定点突变，改掉可能降低其在植物中转录和翻译的序列（95%同源性）；
使用植物偏爱密码子，删除可能形成mRNA二级结构序
不同来源的Bt基因进行拼接和重组，提高表达蛋白稳定性。
抗冻肽的作用机制：一般认为，它们是在低于溶液平衡冰点之下温度阻止冰晶生成，抑制冰晶生长；它们不是作为溶质使水溶液冰点下降，而是吸附于冰晶表面，降低水的冰点。氨基酸序列分析发现，在抗冻肽中有4-7个苏氨酸和天冬氨酸残基可与冰晶结合。
利用基因工程控制果实成熟二条途径
（2）反义RNA技术抑制细胞壁降解
第六章分子标记技术及其在农业中的应用
原理：是将随机引物(通常9-10个碱基)与聚合酶链式反应(PCR)相结合,扩增基因组DNA的不同位点。如果基因组某些区域发生变异而导致特定结合位点的分布发生相应变化,会使产物增加、减少或发生分子量的变化,从而检测基因组DNA的多态性。
RAPD与标准PCR区别RAPD无需专门设计引物，设计引物也不需要知道序列信息，反应中使用的引物是随机设计的，长度9-10bp。引物G+C含量40%以上。标准PCR，必需根据已知的序列设计特点的引物，长度最好在20bp以上，G+C含量应接近50%。
在每个RAPD反应中，只加入一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6～12条片段），而不是标准PCR的一对引物。
RAPD反应使用较低的退火温度（一般36℃），能够产生严格且能重复的基因组特征性产物的多态性；标准PCR一般50℃左右（50-65℃）。
较标准PCR更易程序化，从而提高对基因组DNA进行分析的效率。
扩增片段长度多态性（AFLP）
AFLP标记实际上是RFLP和PCR相结合的一种产物
（1）
（2）从支持物来分主要有：.
薄膜型显微注射法竞争性RIA成熟促进因子
（1）M期促进因子(maturationpromotingfactor,MPF）,真核细胞M期的一个基本调节物质，即引导细胞由间期向M期转变，MPF具有蛋白激酶的活性。
G2期达到高峰，从有丝分裂中期向后期进行过程中消失。
MPF对移植核的作用核受体一般为MII期的卵母细胞，MII期卵母细胞MPF含量高，MPF将诱导移植核发生一系列形态变化，包括核膜破裂（NEBD）、早熟染色体凝集（PCC），NEBD和PCC对重组胚胎发育的影响，取决于供体核的细胞周期。
卵母细胞的活化方式：
电激法（家畜）将G1期（或G0期）的细胞核移入MII期的卵母细胞中；
第八章动植物生物反应器
第九章医（兽）药生物技术
1.基因工程疫苗：基因重组亚单位疫苗、重组活载体疫苗、基因缺陷弱毒疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗、核酸疫苗、转基因植物疫苗
2.生物合成亚单位疫苗：又称基因重组亚单位疫苗，是指将保护性抗原基因在原核或真核细胞（细菌、真菌、昆虫和哺乳动物细胞等）中表达，再以这种生物合成的基因产物制成的亚单位疫苗。
3.基因缺失型弱毒疫苗：通过基因工程造成病毒基因组中负责毒力基因缺失而制成的疫苗称为基因缺失型弱毒疫苗。
4.单克隆抗体（monoclonalantibodym,Mab）：由单个B细胞克隆产生的，在成分上是同质的抗体。
淋巴细胞杂交瘤技术：将免疫动物（小鼠）淋巴细胞与骨髓瘤细胞（人工培养）融合，经培养、筛选和克隆化，建立既能分泌针对预定抗原的特异抗体，又能无限增殖的杂交瘤细胞系，用于生产单抗，该项技术称为淋巴细胞杂交瘤技术。
5.
未融合的骨髓瘤细胞：在培养基中氨基蹀呤（A）作用下DNA合成的主要途径被切断，由于本身缺乏HGPRT酶或TK酶，也不能利用旁路进行DNA合成，因此迅速死亡。
淋巴细胞：本身是短寿的，一般只能存活几天。
杂交瘤细胞：只有淋巴细胞与骨髓瘤细胞发生融合而形成的杂交瘤细胞能够存活下来，因为来自淋巴细胞的染色体弥补了骨髓瘤细胞失去的合成HGPRT或TK酶的缺陷，而来自骨髓瘤细胞的染色体提供了能在体外长期连续继代的特性。
6.几种常见的基因工程抗体：
嵌合抗体第十章微生物饲料
第十一章微生物肥料
又称细菌肥料、生物肥料（biofertertilizer）或接种剂（inoculant）。它是指一类含有活微生物的特定制品，应用于农业生产中，能够获得特定的肥料效应，在这种效应的产生中，制品中活微生物起关键作用。
第十二章微生物农药
基因工程
核心技术
生物技术
细胞工程
酶工程
发酵工程
LB、RB两边界长均为25bp，且正向重复
AS：乙酰丁香酮；OHAS：α-羟基乙酰丁香酮
Vir区基因不必与T-DNA位于同一质粒上，只需处于同一细菌中
分离免疫小鼠的脾细胞
免疫脾细胞
融合细胞与未融合细胞
融合
突变的骨髓瘤
细胞系
用HAT培养基筛选
制备的基本原理：
免疫
失去合成次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）能力
杂交瘤细胞可以生长
克隆所需的细胞（每孔含一个细胞）
测定培养上清液中有无所需Ab，由此选出阳性细胞克隆
产生单克隆的细胞株
|
|
