单细胞测序在发育、癌症和病理过程中的应用(Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease) |
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汇报人:孙振东日期:2021.1.26目录:单细胞RNA测序发展的原因单细胞RNA测学的优点单细胞RNA测序的目标单细胞RNA测序工作流 程及原理单细胞RNA测序的高通量方法单细胞RNA测序的试验设计单细胞RNA测序的数据分析单细胞RNA测序的挑战单细胞RNA测序的应 用发展原因(1)不同的细胞表达不同的基因集合,有产生不同的蛋白组分和细胞表型,进而有不同的分子效应。(2)传统的基因表达研究是对大 量的细胞池进行分析,虽然能够获得大量的RNA,但是在分析精度上存在缺陷,这种方法得到只是一个细胞群的平均表达谱,不能具体到特定细胞 类型的基因表达情况。Eg癌症和疾病中的某类细胞(3)在器官发育中也存在细胞的异质性,对祖细胞群的基因表达分析,不能确定促使祖细胞 向下游分化的具体信号途径。(4)相比于累加分析,单细胞测序也能加深对细胞行为的理解优点(1)可以区分细胞群中各类细胞的分子类型,E g受体、TF、GF、转运体等(2)有助于理解组织学上相似、相邻细胞是如何分化的(3)有利于进一步了解先前的已知细胞的特征,并鉴定 出新的细胞类型(4)提高我们对常态和病态生理过程的认知,开发出新的治疗方法(5)提供人体所有类型细胞的基因表达模式的细节图谱目标 HumanCellAtlasProjectsChanZuckerbergInitiativeAtlasProje ctHumanBioMolecularAtlasProgram工作流程与原理工作流程与原理机械分离/酶解/组合方法FAC S/磁珠分离微流体技术微孔板法工作流程与原理工作流程与原理工作流程与原理高通量方法因为单细胞RNA测序需要分析大量的细胞和RN A,所以高通量测序方法的引入,极大的推动了单细胞测序的发展。如:流体C1微流控系统:1天的时间内,进行1次循环读取96个细 胞;高通量液体IFC芯片:一次可测定800个细胞高通量方法(1)微滴法(代替了微室法)原理:微滴是由油包裹,有两微升的体积, 其内部含有一个单细胞和一个含有一组特异条码寡核苷酸的珠子,细胞裂解之后,寡核苷酸和释放的mRNA杂交。S.SPotter, NatureReviewsNephrology2018高通量方法(1)微滴法(代替了微室法)Drop-seq技术:珠 子、附着的寡核苷酸和退火的mRNAs都从微滴中释放出来,并结合到一个单管中,然后进行反转录。铬微滴法和InDrop技术:水凝胶 珠溶解在微滴中,释放寡核苷酸与mRNAs杂交,并且在微滴中进行逆转录反应。高通量方法(1)微滴法(代替了微室法)铬微滴法较Dro p-seq方法的优势:①铬微滴法可检测单个细胞中更多的基因,获取的数据质量较高。②因为铬微滴可以尽可能将更多的单细胞包裹到含有 珠子的微滴中,所以它能提供待分析细胞群中更多细胞的基因表达谱。③便于启动和操作铬微滴法较Drop-seq技术的劣势:所用试 剂成本高。高通量方法(2)非微流体法a.微孔板法通过简单分拣或流式荧光细胞分选技术,把任意大小的单细胞放置在微孔板上进行 单细胞的RNA测序分析。各种扩增方法可以和微孔板法联合使用,比如:SMARTseq2chemistry,Cel-seq, MARS-seqandSTRT-seq。Hanetal.,Cell2018高通量方法(2)非微流体法微孔板法的优点: ①对细胞的大小不敏感。对细胞敏感程度由大到小的技术排序:流体系统>微滴法>微孔板法②需要的设备简单,启动成本低。③cDN A序列的全覆盖。高通量方法(2)非微流体法b.CytoSeq技术:优点:可以待分析细胞的数量自由调控微孔的数量。c.SPL iT-seq技术:优点:减少设备需求的数量,并降低文库构建时的成本。试验设计考虑因素:(1)细胞数量(2)每个细胞的数 据读取(3)生物复制。虽然用于分析的细胞数量越多越好,但成本也会增高。不同技术对单个细胞序列读取数量和质量是不一样的, 应依据细胞之间的相似度进行选择数据分析(1)表达基因的鉴定将scRNA-seq数据去卷积,根据条形码的特异性匹配细胞,确定扩增过 程中,cDNA的比例与扩增前逆转录结果相一致,最终基因表达读取的次数就代表了基因表达的模式。数据分析(2)质控为确保用于scRN A-seq分析的细胞正常,应进行质控,移除异常细胞可以是数据结果更加合理。①被认为应当表达的基因表达数量少的细胞,会弱化数据集 ②有高比例的线粒体DNA被读取的细胞,可能死掉了,胞膜通透性增加,是胞质RNA泄露。③因为红细胞中有大量血红蛋白的表达,也应当被 移除。数据分析(2)质控Liaoetal.,scientificdata2020数据分析(3)分析策略a.降维:通 过各种预测模型算法使高维数据变为低维数据b.重复聚类:优点:①可以基于复杂的基因表达特征分类,不局限于细胞特异性的标记基 因;②可以克服关键基因遗漏带来的问题。数据分析(3)分析策略b.重复聚类:重复聚类分析将细胞类型逐渐进行细化,但需要注意 不能基于噪音聚类S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018数据分析(3)分析策略b .重复聚类:为评判分类的合理性,需要参照基因表达的热图,新细胞亚型间基因表达模式的差别还需要正交实验进一步验证(eg免疫荧光 、FISH(原位荧光杂交)等)。Liaoetal.,scientificdata2020数据分析(4)数据分析软件Se uratSCDESinceraRaceIDAltAnalyzeHiLoadG-HCMonocleRCBackspinSCellW ishbonePagodaWanderlustscLVMDPTNMFp-Creode挑战(1)有限的实验材料实验问题:每个细胞中 含有总RNA量为10皮克,mRNA量为0.1皮克。解决方法:扩增扩增问题:cDNA在扩增过程中是非线性的,使得序列的读取数量不 能真实的反应细胞内的基因表达情况。解决方法:UMI:uniquemolecularidentifier挑战(2)单细胞的捕 获获取单细胞的方法:①微操作:可以保证分理出的是单细胞,但劳动量大不能达到高通量的要求。②激光捕获显微解剖(LCM):可获得 一些空间上的信息,但依旧是低通量。理想做法:使用LCM干净地捕获到一个细胞的内容物,而不损伤RNA。③FACS(流式荧光细胞分选 仪):高通量,可用于少量样本的富集。④scRNA-seq技术挑战scRNA-seq技术:优点:高通量,可同时检测大量细胞,在初 始组织中的每一种细胞都可以被检测到,且不需要细胞特异性的标签。挑战scRNA-seq技术:技术问题:(1)在分离细胞中,会 使空间信息丢失,不能重构单细胞分辨率的三维基因表达图谱。解决方法:借助生物信息学的手段,根据已知特定位置的基因表达特征来确定空间 位置。新类型细胞空间位置通过原位杂交和免疫荧光技术来确定。挑战S.SPotter,NatureReviewsNephr ology2018scRNA-seq技术:挑战scRNA-seq技术:技术问题:(2)组织中各类细胞的形态,状态或对分离环境 的耐受程度不同,获取地单细胞悬浮液中细胞类型的比例能否很好地反应初始组织的情况。解决方法:尽可能采取温和的方式处理组织,或在制 备悬浮液的过程中加入细胞保护液挑战scRNA-seq技术:技术问题:(3)酶解组织获取单细胞的过程中,为响应新的,且酶解温度是 37℃的环境,细胞会改变表达模式(Eg:FOS和JUN家族的基因会表达上调)。这种基因表达的人工产物会影响单细胞RNA测序的最终数 据。挑战scRNA-seq技术:解决方法:①用机械均化制成的细胞核中进行RNA-seq。核RNA-seq技术问题:a .只有少部分的胞质RNA在细胞核中,因此技术产生的噪音也会增加,人们也怀疑核中的RNA比重是否能够真实的反应整个细胞的RNA。 b.核中的RNA大部分是未成熟的,还含有内含子,使数据分析也变十分复杂。挑战scRNA-seq技术:解决方法:②在细胞裂解过程 中,使用转录抑制。抑制剂问题:a.转录抑制剂吸收慢,且细胞为了吸收抑制剂,会表达相应的转运子,也会改变基因表达谱。b. 该方法只抑制了RNA的合成并未考虑RNA的分解带来的影响。挑战scRNA-seq技术:解决方法:③使用冷适应的蛋白质酶分离单细 胞,可以很好的抑制基因表达模式因处理方式的改变。挑战(3)噪音①生物噪音(20%)基因并不是以一个稳态的方式进行表达的,它 具有搏动性和爆炸的特点,即只在一个短时间内进行活跃转录,这意味着不同时刻特定细胞内基因表达量是波动变化的。挑战(3)噪音②转录水 平的测定方法(80%)scRNA-seq对于低水平表达的基因,是很难检测到的。逆转录和扩增的无效性也增加了技术噪音。解决办法 :无监督聚类。S.SPotter,NatureReviewsNephrology2018应用胰腺:在发育过程中 ,有些单细胞表达多种未来可能分化的细胞类型的基因。(1)发育①多谱系启动应用(1)发育①多谱系启动肾囊泡的scRNA-s eq分析表明,细胞会处于谱系决策的中间阶段.。S.SPotter,NatureReviewsNephrology20 18应用(1)发育②器官发育图谱单细胞转录谱可用于创建器官发育的高分辨率基因表达图谱。这种图谱将定义不同发育阶段每个细胞类型 表达的所有转录因子、生长因子和受体,全面表征转录过渡状态。策略:分离发育器官的细胞→进行高通量的scRNA-seq分析→无监督聚 类→空间重建早期肾脏发育、肺发育应用(1)发育②器官发育图谱早期肝脏发育胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)来自帽间充质肾祖 细胞应用(1)发育②器官发育图谱基质细胞才是GDNF因子的重要来源应用(1)发育②器官发育图谱肺发育表征了双潜能细胞,鉴定 出新的细胞类型标记,发现了发育多阶段中的多种细胞类型的转录调控子,并定义了这些细胞的全基因表达模式。应用(3)发育③器官和类器官 发育的意义对Nkx2.5杂合缺失的小鼠心脏分析,发现心肌细胞的串扰是心内膜细胞成熟所必需的。应用(3)发育③器官和类器官发育的 意义scRNA-seq研究iPSCs在形成肝芽时基因表达谱的变化,发现多能基因的逐渐下调,控制内胚层形成的基因的上调。应用(3)发 育③器官和类器官发育的意义移植的肝脏器官进行scRNA-seq分析表明,肝脏血管生成的过程中缺氧、炎症和基质重塑的基因也发挥作 用。应用(2)癌症对人的结直肠癌和正常黏膜研究,发现TGFB1是癌症相关成纤维细胞(CAFs)中表达最上调的差异表达调控基因。通 过对基因表达模式的分析,研究人员可以将CAFs分为三种亚型。应用(2)癌症鉴定出一种新类型的胶质瘤特异性小胶质细胞应用(2)癌症 人乳腺癌组织的scRNA-seq分析确定了与上皮向间充质转化、干细胞、血管生成、增殖和肿瘤复发有关的基因的可变表达。应用(2)癌症 scRNA-seq也被用来检测黑色素瘤组织的细胞组成,揭示了多种细胞的表达特征。证明转移性透明细胞肾癌中的癌细胞异质性,确定出有助 于指导治疗策略的活性信号通路,为患者提供个体化治疗。应用scRNA-seq为正常肾脏生理提供重要的理论依据的同时,定义了主细胞和插 层收集导管细胞的完整的受体表达谱,揭示了它们之间存在着细胞-细胞串扰。阐明了成年斑马鱼肾脏惊人再生能力的机制。(3)正常和疾病肾脏 应用(3)正常和疾病肾脏对于狼疮性肾病提供了对致病途径的见解,为病变肾脏确立了新的生物标志物和可能的治疗靶点。总结scRN A-seq方法的限制因素:①因技术缺陷,在数据结果中存在噪音。②单细胞测序成本太贵。但是这项技术会提高我们对发育、生理 和疾病系统的认识,促进描绘基因表达图谱的发展,有助于个体化治疗的进步。Thanks致力于确定每种细胞类型的差异表达基因的集合。Eg :HumanCellAtlasProjectsHumanBioMolecularAtlasProgramChan ZuckerbergInitiativeAtlasProjectFeaturebarcode的检测的珠子上,除了有带有 polyT的寡核苷酸,还有两个带有captureseq的序列,它可以结合抗体检测细胞表面的蛋白,同时也可以对敲除基因的靶点进行检 测。三个图依次向右,分别表示三个肾脏样本中每个细胞的基因数目、独特的分子识别码和线粒体基因百分比。将线粒体基因表达比例<30%和基因表达数目在>200和<2500之间的细胞数据被保留在初始逆转录的寡核苷酸引物中加入8碱基的特异分子标识符(UMI),扩增结束后,含有相同UMI标记的所有cDNA被压缩成一次mRNA和寡核苷酸的杂交,最终读取的是首次逆转录产生的cDNA量,而避免了扩增对细胞基因表达比例的影响。通过聚类,将同类细胞获得的信息进行互补,就可以得到稳定的基因表达谱。增加每个集群中的细胞数量提高了这种互补方法的有效性和分析的准确性。scRNA-seq数据分析也表征了双潜能细胞,鉴定出新的细胞类型标记,发现了发育多阶段中的多种细胞类型的转录调控子,并定义了这些细胞的全基因表达模式。 |
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