组织石蜡切片制作技术要点一、动物致死（一）动物致死方法的选择：空气栓塞法。不宜用于血管注射标本的制作乙醚麻醉对下丘脑神经内分泌物染色标本不
利股动脉放血有利于肠系膜铺片制作（二）致死方法：麻醉法：乙醚或氯仿棉球与动物密封于钟罩或有盖玻璃缸麻醉4%戊巴比妥静脉注射（1毫升
/公斤体重）20%乌拉坦（氨基甲基乙酯、尿烷）腹腔注射（5毫升/公丘体重）空气栓塞法：50毫升注射器从兔耳静脉注入击头法：用重物猛
击大、小鼠后部或将其头猛撞桌沿，一击而死断头法：青蛙、小鼠等小动物，用剪刀剪去头部，并可用探针插入椎管中，破坏脊髓较大动物如兔等，
用斧头迅速将其砍死股动脉放血：动物吸入乙醚或氯仿麻醉，立即切开动脉放血二、取材刀剪锋利，不能来回挫动组织。熟悉取材的特点。最好在心
脏还在跳动时取材，脏器争取在死后30分钟内完成尽量取大些，固定后将受挤压或损伤的部位修去。厚度最好在2毫米左右，长、宽尽可能的短小
，使固定液迅速均匀渗入组织内部将组织展平，尽可能保持原状；神经（如坐骨神经）、肌组织（如肌梭）等，将其两端用线扎住在木片（棒）上固
定取材部位：胰腺取尾部（胰岛较多）脊髓取颈、腰膨大处（神经元较多）肺取有细支气管及带有软骨片的小支气管部位选择合适的动物品种：肥大
细胞取大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片内耳取豚鼠胰岛细胞取豚鼠（聚集成团）卵巢取猫（看到各级卵泡）运动终板取小鼠肋间肌等甲状腺
、甲状旁腺取犬的材料猪肝的肝小叶十分典型（结蹄组织较多）选择切面（纵切、横切、冠状切或矢状切）：管状器官以横切为佳：如回肠、食管、
气管器质性器官如肝脏，肺等保证有被膜和实质两大部分组织保持清洁，用生理盐水将组织上的血液、污物、黏液、食物、粪便等冲洗干净，再入固
定液，不要损伤组织切除不需要的部分，特别是组织周围的脂肪等，尽可能切去三、固定（一）固定的一般要求组织块不宜过大，一般以厚5毫米，
长宽不超过15X15毫米固定液渗透力强，又不使组织过度收缩或膨胀固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜，最好在固定组织的器具底部垫
几层滤纸或脱脂棉，使固定液从上、下、左、右、前、后几个部分能渗入组织块组织固定的时间长短以不同固定液、气温和组织块大小有关：温度高
，固定时间短；组织块过大，固定时间延长软组织或较大块组织，先经2~3小时固定，再修成小块，重新固定特殊要求的组织要用特殊固定液，如
显示某些结构用相应的固定液（二）固定剂与固定液1．固定剂（1）甲醛（福尔马林）还原剂。水中饱和度为37~40%甲醛水溶液即福尔马林
常用10%福尔马林：37~40%甲醛水溶液10毫升加入水90毫升（实则4%浓度）渗透力强，固定均匀，对组织收缩较少，多用于大块组织
固定，如全脑或手术大标本等经酒精加水、石蜡包埋，收缩强烈细胞核的染色优于细胞质长期固定，需流水冲洗24~48小时配制时以自来水代替
蒸馏水也可用碱性物质中和，但中和后的甲醛水溶液久存后易变成酸性：在甲醛水溶液中加入足量的碳酸镁或碳酸钙用缓冲液保持中性pH7.0较
适用甲醛水溶液应无色透明，若变混浊或白色沉淀，不易使用长期固定于甲醛的标本，易产生暗褐色结晶样沉淀称福尔马林色素，多附着于充血、出
血和血液溶解的组织如肝、脾，不溶于水、酒精、二甲苯、丙酮、甘油、脂溶剂及稀酸，影响染色效果。常用下法去除色素氨过氧化氢水溶液浸泡
法将未染色的切片，浸泡于3%过氧化氢水溶液25毫升，加浓氨水1滴，1~2小时后，充分水洗再染色氨酒精浸泡法：将切片浸泡于25%氨水
1毫升、75%酒精200毫升30分钟，水洗染色碱酒精浸泡法：将切片浸泡于1%氢氧化钠或钾1毫升、75%酒精100毫升10分钟，水洗
染色（2）酒精（乙醇）还原剂，不能与氧化剂如铬酸、重铬酸钾及锇酸混合用于固定的酒精浓度为80~95%具有固定、硬化、脱水等作用渗透
加弱，能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白（能溶于水）核着色不良，不宜固定线粒体50%酒精能溶解脂肪、类脂、血红素及其他色素高尔基复合体、
线粒体固定不能用酒精酒精固定后容易变硬，对组织收缩较大（缩小约20%）单纯作固定剂用于糖原固定（3）升汞（氧化汞、氯化高汞）白色粉
末或针状结晶，剧毒室温下饱和水溶液溶解度5~7%能沉淀蛋白质，对类脂及碳水化合无固定作用穿透快，对组织有一定收缩作用。常与冰醋酸、
铬酸盐及甲醛等混合使用经升汞及其混合液固定的组织，能较好显示细胞核，用卡红、沙黄、苏木精等染色很好；染色质强烈地被碱性染料着色，细
胞质的结构也能被酸性染料、碱性染料着色用升汞固定后，需脱汞（组织块脱汞法）（4）醋酸（乙酸、冰醋酸、冰乙酸）纯醋酸在10℃以下结晶
成冰，称冰醋酸，冬季须加温溶解能与酒精、水、氯仿等混合不能凝固细胞质中的蛋白质，但能使细胞核内的蛋白质沉淀，对核染色质或染色体固定
与染色很好不能保存糖，不能固定脂肪和类脂固定线粒体和高尔基复合体时只能用0.3%以下的浓度对组织穿透很快，小块组织固定1小时对组织
有膨胀作用。常与酒精、甲醛、铬酸混合使用（5）苦味酸（三硝基酚）干燥时极易爆炸，常以饱和水溶液贮存在水中的溶解度为0.9~1.2%
溶于酒精（4.9%）、氯仿、醚、苯（10%）及二甲苯能沉淀蛋白质，对脂肪、类脂无作用其酒精溶液能固定碳水化合物渗透力弱，固定后细
胞收缩明显，经酒精脱水和浸蜡包埋后收缩加剧（可达50%）软化火棉胶，苦味酸及其混合液固定者，不宜用火棉胶包埋软化皮肤，经含苦味酸固
定液固定的指皮、头皮等组织，易于制作完整切片，无硬脆现象溶化肌腱黏蛋白，用苦味酸固定液固定腱组织，再以苦味酸饱和水溶液100毫升加
氯化钠3克浸泡3天，可制作满意的肌腱切片用含苦味酸固定组织不宜超过24小时，否则对苏木精等碱性染料不利固定后组织显黄色，转入70%
酒精一定时间洗去苦味酸，可在酒精中滴入少量耍赖到锂水溶液或浓氨水加快脱色固定肾脏，结构不清，染色较差（6）重铬酸钾橘红色结晶，水溶
液呈酸性，固定多用0.5~1%水溶液强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，与甲醛混合只管12~24小时未酸化的重铬酸钾，使蛋白质具有不
溶性，能固定脂质，使其不溶于性脂溶剂。固定线粒体和高尔基复合体加入醋酸：使蛋白质沉淀，使细胞质和细胞核沉淀呈网状，保存染色体穿透速
度快，收缩小，对组织稍有膨胀作用对酸性染料染色良好经重铬酸钾、铬酸、铬酸盐等固定的组织，流水冲洗后入脱水剂2．固定液良好的固定液特
性有较强的渗透力，能迅速渗入组织内部；不使组织过度收缩或膨胀，并能使组织内欲观察的成分得到凝固为不溶性物质；能使组织达到一定硬度并
获得较佳的折光率和对某种染料具有较强的亲和力分两类单纯固定液：只由一种固定剂组成的液体混合固定液：由二种或二种以上固定剂组成的液体
（1）甲醛生理盐水溶液：37~40%甲醛液100毫升，氯化钠8.5克，自来水或蒸馏水900毫升（2）中性10%甲醛液：37~40%
甲醛水溶液100毫升，水900毫升，碳酸钙或碳酸镁足量（3）中性缓冲甲醛液（pH7.0）37~40%甲醛液100毫升，水900毫升
，磷酸二氢钠（水）4克，磷酸氢二钠（无水）6.5克（4）蔗糖甲醛液（Lillie）(甲醛钙)：37~40%甲醛水溶液10毫升，乙酸
钙（水）2克，蔗糖30克，蒸馏水加至100毫升2~5℃固定18~24小时，流水洗涤（5）酒精甲醛液（AF）无水或95%酒精9份，4
0%甲醛1份用于肠系膜及皮下组织铺片，对肥大细胞染色较好，对弹性纤维和胶原纤维染色也很好（6）Carnoy液冰醋酸1份，氯仿3份，
无水酒精6份浸透快，固定时间为宜过长，小块组织2~3小时固定后直接入无水酒精脱水常用于糖原及尼氏体固定适于甲基绿派洛宁染色显示DN
A和RNA（7）Bouin液饱和苦味酸水溶液75毫升，甲醛水溶液（40%）25毫升，冰醋酸5毫升渗透力强，对组织固定均匀且收缩较小
，染色效果好冰醋酸固定染色质，苦味酸硬化组织，甲醛调节两种试剂对组织的膨胀作用对绝大多数器官、组织固定良好固定12~24小时为宜固
定后以70~80%酒精洗涤，可在酒精中加少量饱和碳酸锂水溶液促进黄色的清除（8）Susa液贮存液：升汞4.5克，氯化钠0.5克，三
泉氯醋酸2克，蒸馏水80毫升应用液：用时加冰醋酸4毫升，甲醛20毫升固定1~24小时，固定后直接入80%酒精脱水渗透加强，对组织
收缩较小多用于内耳等难于渗透的组织固定（9）Stieve液：饱和升汞水溶液76毫升，甲醛水溶液（40%）20毫升，冰醋酸4毫升渗透
力强，作用与Susa液相似固定大块组织效果较好固定一般12~24小时固定后直接转入70%酒精，最好脱汞（10）Regaud液3%重
铬酸钾水溶液80毫升，中性甲醛20毫升（11）AGFD固定液丙酮（A）50毫升，冰醋酸（G）2毫升，福尔马林（F）4毫升，蒸馏水（
D）3毫升将眼球取下，不经固定，直接投入固定液，眼球能保持舞弊的状态，不会发行变形、凹陷。眼下球固定一周，将原液倒一半，加一倍丙酮
再固定5天，直接转入95%酒精脱水（12）Kolmer液：5%重铬酸钾水溶液20毫升，10%甲醛水溶液20毫升，冰醋酸5毫升，5%
三氯醋酸水溶液5毫升，10%醋酸钠水溶液5毫升适于固定整个眼球和神经组织固定24小时（13）4%多聚甲醛：多聚甲醛4克，PBS（p
H7.2-7.4）100毫升（三）固定方法1．蒸汽固定法较细小而薄的标本，血液或细胞涂片及某些薄膜组织等，用锇酸或甲醛蒸汽固定血涂
片锇酸固定：有盖培养皿一个，滴入1~2%锇酸水溶液2~3滴，将血涂片放入其中，30至60秒后水洗染色，封片或其它处理2．注射或灌注
固定法注射固定法：组织块体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物固定将固定液注入血管，经血管分枝到达整个组织和全身，
使其得到充分固定灌注固定法：灌注固定完成后，将组织展示会、器官或整个动物放入固定液固定局部灌注固定法：肺：将固定液从气管或支气管注
入，速度不宜太快，注入量适当，以免胀破肺泡眼球：从眼后房注入固定液肝、肾等脏器，从肝动脉、肾动脉注入固定液，并切断静脉脑：动物麻醉
后，暴露颈动脉，以注射针向头部方向注入固定液，液体的出品可在颈静脉或左心房上，有时，在注入固定液前，先注射生理盐水至无血色为止全身
灌注固定法：较大动物如兔、猫、狗、猴及人体，采用输液的方式，将固定液从一侧颈总动脉或股动脉输入，从另一侧切开静脉放血，即输液与放血
同时进行输入量：兔、猫500~1000毫升狗、猴1000~2000毫升输完后，不必即刻取材有些小动物如大小鼠，在吸入乙醚深度麻醉后
，打开腹腔，纵向切开心包膜，用纱线在动脉弓打一松结，用50毫升注射器，选用适当的针头同，从左心室向主动脉方向刺入，针尖刺入后，随手
用纱线扎紧固定，在右心房开一孔放血。一般先用与该动物等温的生理盐水慢慢注入血管洗涤，待流出的液体不见血色，再将固定液注入至固定液分
布至全身小块组织固定法：从人体或动物的小块组织，立即置入固定液固定（四）固定的目的使组织内的各种物质成分如蛋白质、脂肪、糖、酶等成
人凝固成不溶性物质，以拿堪原有的状态；迅速阻止组织、细胞死后变化，防止组织自溶、腐败，尽量保持生前的状态和结构；使组织块在后续的操
作如脱水、包埋、切片、染色等不易破坏；使组织内的不同物质产生不同折光率，染色后便于鉴别、观察；使不同组织成分对染料产生不同的亲和力
，染色后易于辨认；防止细胞过度收缩或膨胀而引起原有形态结构的改变；硬化组织，便于制作薄片（五）固定后处理洗涤、脱汞、脱钙1．洗涤
：包括水洗和酒精洗涤两种流水冲洗或水浸泡：经铬酸或铬酸盐固定的组织，必须流水冲洗24小时左右，否则在进入酒精时会产生沉淀而影响染色
酒精洗涤：苦味酸固定的组织，在70%酒精充分洗涤，尽量除去黄色含酒精固定的组织，一般用低一级的酒精洗涤数次。如95%酒精固定，用8
0%酒精洗涤2．脱汞：用升汞固定的组织，作脱汞处理组织块脱汞：固定后流水冲洗，逐级转到70%酒精，加少许碘酒，待棕色消失后继续加入
，直至脱汞酒精呈极浅的棕色，最后用5%硫代硫酸钠去碘3．脱钙骨、牙齿等组织，须脱钙一般方法：硝酸脱钙：硝酸5毫升，水或70%酒精9
5毫升。小块组织脱钙2天左右二乙胺四乙酸（EDTA）脱钙：EDEA15克，蒸馏水或PBS（pH7.4）1000毫升，加氢氧化钠助
溶。脱钙14天左右脱钙后流水冲洗，碱性液（硫酸钠等）中和四、脱水脱水剂能溶于水，又能溶于透明剂；脱水剂溶于水并溶于包埋剂如石蜡酒精
、丙酮、正丁醇、叔丁醇、石炭酸二甲苯单纯脱水剂：酒精（乙醇）、丙酮脱水兼透明剂：正丁醇、叔丁醇其它：冬青油（水杨酸甲酯）、苯甲酸甲
酯，脱水至95%酒精后，直接入冬青油等，组织透明后下沉底部，换一次，最后经二次二甲苯洗去水杨酸甲酯或苯甲酸甲酯味道，浸蜡包埋1．酒
精：无水酒精或95%酒精脱水能力强，使组织硬化；但收缩强烈变脆90%以下酒精能保存组织并无收缩变化，常用80%酒精保存组织组织块脱
水：从低浓度到高浓度。逐渐被酒精替代一般组织，70%酒精开始胚胎组织或较柔软的组织，50%以下浓度开始将95%酒精稀释成不同浓度
的酒精称为梯度酒精：10%酒精35%酒精50%酒精70%酒精80%酒精90%酒精95%酒精10.536.852.673.784.
294.795%酒精2次，无水酒精2次蒸馏水89.0563.247.426.315.85.3起始浓度胚胎组织或较柔软组织一般组织每
级酒精脱水时间：30分钟左右，低浓度酒精可延长脱水时间2．丙酮：脱水能力比酒精强，但收缩厉害主要用于快速脱水或固定兼脱水脱水时间1
~3小时3．正丁醇：脱水能力弱，对组织收缩小能与水、酒精、石蜡混合经它脱水的组织块，直接浸蜡包埋适于结缔组织少的器官组织，脱钙骨4
．石炭酸二甲苯：脱水，肠系膜铺片，植物标本染色后的脱水五、透明将组织内的脱水剂（不溶于包埋剂）替换掉二甲苯、冬青油1．二甲苯：易挥
发，长期接触会对黏膜有刺激作用透明能力强。易使组织收缩变脆不能搁置过久，不能超过2小时，小块组织30~60分钟，较大组织适当延长组
织块局部不透明而呈白色混浊，脱水不彻底，返回脱水剂脱水再透明2．冬青油（水杨酸甲酯）易溶于醇、醚和冰醋酸，难溶于水浸入速度慢，一般
组织块脱水至95%酒精后，直接入冬青油数小时至数天，最好以无水酒精脱水后再入冬青油制作骨组织的石蜡切片，可用冬青油-苯甲酸甲酯（5
：3）混合液透明冬青油还可用于染色后的整体标本透明和胚胎标本透明：切片染色脱水后，经冬青油得力，不加盖玻片，临时镜检而不易干3．苯
甲酸甲酯不能与低浓度酒精混合经各级酒精脱水至95%酒精，直接入苯甲酸甲酯透明12~24小时，换液一次，可入二甲苯二次浸泡再浸蜡可用
于火棉胶切片的脱水透明无水酒精-二甲苯（2：1）、无水酒精-二甲苯（1：1）、无水酒精-二甲苯（1：2）、二甲苯、二甲苯一般标本：
无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ一般标本：无水酒精-二甲苯（1：1）、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ比精细的标本：无水酒精-二甲苯（
2：1）、无水酒精-二甲苯（1：1）、无水酒精-二甲苯（1：2）、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ较精细的标本：无水酒精-二甲苯（1：1）、无水
酒精-二甲苯（1：2）、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ苯胺油（安尼林油）：微溶于水，能与醇、醚、苯及其它多种有机溶剂混合，随水蒸气挥发，应避水
保存脱水兼透明剂组织经各级酒精至70%酒精，可与苯胺油混合一般在酒精中容易变脆的组织如蛙卵，可用苯胺油透明70%酒精-苯胺油（1：
1）85%酒精-苯胺油（1：2）95%酒精-苯胺油（1：2）纯苯胺油全部透明透明后的组织块用甲苯冼两次苯胺油可用于染色后的分色六、
石蜡包埋石蜡冷凝后脆性大，可加一定量的黄蜂蜡（1：9）增加石蜡的韧性50℃以下为软蜡，50℃以上为硬蜡夏天用硬蜡包埋，冬天用软蜡包
埋软的组织用软蜡包埋，硬的组织用硬蜡一般组织用熔点52~56℃，切4微米以下的切片用56~60℃的石蜡，较厚的切片如胚胎连续切片，
用熔点52~54℃的石蜡新蜡应先熔化一次，使其中的挥发性物质蒸发，以免包埋准绳凝时出现蜡花（蜡块不均匀），不能切片石蜡多次熔化会使
熔点升高新蜡或旧蜡熔化后用加热的漏斗过滤一次，除去杂质浸蜡一般5微米厚的实质性器官如肝、肾、脾等，总浸蜡时间约2~3小时。均在温箱
中进行：二甲苯-石蜡（1：1）30分钟左右熔蜡Ⅰ1小时熔蜡Ⅱ1小时熔蜡Ⅲ30分钟用熔蜡Ⅲ的石蜡液包埋浸蜡温度最好是石
蜡刚熔化的温度，或在蜡杯底部有小部分未熔完的蜡的温度包埋机浸蜡：左面放低熔点石蜡，30分钟右面放高熔点的石蜡45~60分钟顶
部的石蜡为包埋蜡包埋切面朝下，组织放在正中（包埋模具的正中），模具比组织大2毫米左右凝固后的蜡块要修整，正方形或长方形，蜡块右上角
修去一小部分，使蜡片容易分离蜡块避光避热保存七、切片（石蜡切片）轮转式切片机修蜡块：组织周围多余石蜡切去，四周保留2毫米蜡边留得过
少，分片困难或易破坏组织留得过多，脱蜡时多用二甲苯蜡块修成正方形或长方形，上下两边平行，否则切片时蜡带弯曲蜡块固定在切片机上，切片
装上并夹紧调整刀的角度（刀与组织块平面所成的角度），一般4~6度移动刀台，使蜡块与刀片接近调节TRIM/SECTION旋钮到TRI
M，调厚度（稍厚），旋转手轮（顺时针）切出的蜡片显示切面都切到，换至SECTION（切片）调节所需厚度（一般5~10微米，免疫组化
2~5微米）均匀旋转手轮，切片呈带状，用毛笔从刀口上顺刀刃方向取下湿捞法：大量切片，科研将蜡带分成单片，放入冷水里事先打开摊烤片机
，设置温度：摊片水温35~50C，烤片60C从冷水中捞出切片，放在热水里，蜡片自然展开用镊子趁势将其拉直展平用干净的载玻片斜插热水
中，并靠近切片用镊子将展平的切片轻轻捞在载玻片上并移至玻片右三分之二至三分之一位置烤片。60℃1小时，37℃温箱过夜，待染摇动手轮
不均匀会使切片厚薄不一干捞法：切片数量较少，或习惯本法分离蜡带成单个蜡片在干净载玻片涂一蛋白甘油，加数滴蒸馏水移在加热至45℃恒温
摊片板（恒温水浴箱）上，组织自然展开用细针或摊片镊将组织展平并摆正位置倾斜载玻片，蒸馏水流下，将载玻片放在恒热的金属板上烘干石蜡切
片常见问题及处理切片不成带状：室温过低；石蜡过硬和石蜡黏度不足（在石蜡内加适量蜂蜡增加黏度）；蜡边过小或不平蜡带弯曲：蜡带两侧大小
不等；刀片不锐利蜡片成卷：刀不锐利或不清洁；刀倾斜度过大；石蜡过硬切片皱褶：石蜡太软；浸蜡不够；刀片钝或倾斜度过小切片厚薄不一：组
织脱水、浸蜡等处理不当；刀片钝；切片机不佳；刀片和组织块没固定紧切片因结缔组织呈不透明白色而破碎：脱水不彻底；透明不足切片呈碎卷状
：脱水、透明、浸蜡时间过久；蜡温过高切片出现纵纹：刀刃有小缺口；石蜡不清洁；组织内有钙盐沉积蜡块底边呈白色：刀倾斜度不足，使刀、刀
片碰撞蜡块切片黏刀：刀刃不洁，可用软布或手指沾二甲苯以反刀口方向向刀口抹掉；加大刀倾斜度；刀钝蜡块向上运行时带走切片：刀钝；刀刃背
面沾积有蜡；室温高或用冰块冷却蜡块；蜡带静电反应（室内过于干燥）八、染色石蜡切片染色大致包括：脱蜡、水化、染色、分色、脱水、透明、
封固（封片）。所有的过程都在液体中进行，不能让玻片干燥脱蜡：用二甲苯浸泡两次，每次5分钟左右，冬天加温，陈旧的二甲苯要换试剂或延长
脱蜡时间水化：用无水酒精洗两次，残余的石蜡、二甲苯；经各级酒精下行，逐步使组织充满水分；含汞的组织，进入70%酒精前，用碘酒精处理
10分钟左右，5%硫代硫酸钠去碘，水洗，染色（切片脱汞法：切片脱蜡，经下行酒精至70%酒精，转入由70%酒精配制的1%碘酒中10
分钟左右，再用5%硫代硫酸钠去碘）含苦味酸固定的组织，在70%酒精浸泡至无黄色长期固定于福尔马林的组织，在70~80%酒精内滴加碱
性试剂如氢氧化钠、氨水等进行处理染色：常规染色是苏木精染细胞核和碱性物质，伊红染细胞质和酸性物质如胶原纤维、弹性纤维分色：苏木精染
色用盐酸酒精分色，氨酒精蓝化。盐酸掉入苏木精染液会影响苏木精着色伊红对比染色，用95%酒精分色。伊红不上色可能是切片含氨，反复清洗
或更换伊红染液前的各级酒精（80~95%）；细胞或酸性物质较多的组织，或冬天气温较低影响着色，延长染色时间脱水：无水酒精2次透明：
二甲苯2~3次封片：中性树胶、盖玻片稍大于组织，防止气泡结果观察：无杂质，无气泡，核蓝色，质红色（染料：嗜酸性、嗜碱性和中性，细胞
质碱性，细胞核酸性）天然染料如苏木精和卡红，多用媒染剂如钾明矾、铵明矾、铁明矾等；合成的煤焦油染料不需加媒染剂有些染料如核坚牢红需
加媒染剂，增强染色能力或提高染色的选择性，称为媒染染料媒染用于染色前，如铁苏木精法，先用铁明矾媒染，然后用苏木精染色，最后用铁明矾
分色媒染也可与染料配成混合液，如钾矾苏木精、矾卡红等染剂：不参与染色反应，只是增强染色能力，如在美蓝中加适量氢氧化钠或在伊红内加少
量冰醋酸，增强染色能力用优质的伊红则不需加冰醋酸，可获得良好的染色效果在伊红内加冰醋酸可增强染色，在酒精中不易褪色分色剂、脱色剂、
分色剂、鉴别剂：脱掉组织或切片过染的染料酸性分化剂：多用冰醋酸或盐酸，0.1~1%水溶液或70%酒精溶液盐酸分化液多用于苏木精染色
后的脱色冰醋酸多用于合成的煤焦油染料媒染分化剂：铁苏木精染色后的铁明矾起分色作用氧化分化剂：弱漂白剂赤血盐及苦味酸能将切片上所有染
色无选择地脱掉，结合不牢脱掉。保留一部分颜色Weigert髓鞘染色法用赤血盐分色苦味酸可褪掉苏木精的染色央VanGieson染色
中需深染苏木精）（Delafield苏木精：苏木精4克溶于无水酒精25毫升，倒入10%铵明矾水溶液400毫升内，放在有光处3~5天
，过滤，加甘油、甲醇各100毫升，数日后过滤。能长久使用一般染色数分钟，也可以稀释50~100倍染色4~24小时对细胞核和嗜碱性颗
粒染色效果良好Ehrlich酸性苏木精液：苏木精2克溶于95%酒精100毫升，加蒸馏水及甘油各100毫升，钾明矾3克，冰醋酸10毫
升。混合后呈红色，用纱布封闭瓶盖，两周后成熟，转为红紫色切片染色数分钟用蒸馏水或50%酒精稀释4~5倍，小块组织染1~2天。适合
于块染Grenacher钾明矾卡红液：3~5%钾明矾或铵明矾水溶液100毫升，卡红2克，混合煮沸1小时，冷后过滤，加甲醛1毫升、蒸
馏水至100毫升切片染色1~24小时，充分水洗至不褪色细细胞核染液，不适于块染。肝脏巨噬细胞核的染色核坚牢红液：核坚牢红（Nucl
earFastRed）0.1克，5%硫酸铝水溶液100毫升，加温煮沸溶解，冷后过滤切片染色3~15分钟，核红色对含汞固定的组织
染色效果最好核坚牢红也可染细胞质：核坚牢红0.1克溶于0.1~0.5%冰醋酸水溶液，切片染色3~10分钟，细胞质粉红色）苏木精-伊
红染色法（HE染色）基本步骤：二甲苯Ⅰ脱蜡，二甲苯Ⅱ脱蜡无水酒精Ⅰ洗涤，无水酒精Ⅱ洗涤95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒
精、蒸馏水洗（95%酒精、90%酒精、80%酒精、70%酒精、50%酒精、35%酒精、10%酒精、蒸馏水洗）（含汞固定：95%酒精
、90%酒精、80%酒精、70%酒精加1%碘酒10分钟，5%硫代硫酸钠洗，蒸馏水洗）（苦味酸固定：95%酒精、90%酒精、80%酒
精、70%酒精泡至无黄色、蒸馏水洗）苏木精染色5~15分钟，如Zenker液固定的组织需加长染色时间自来水洗去多余的染料0.5%盐
酸70%酒精溶液分色至核呈红紫色，肌原纤维、肌组织及细胞质无色，通过70%酒精洗涤、氨酒精返蓝后在显微镜下检查）70%酒精洗涤，氨
酒精蓝化经80%、90%、95%酒精洗去碱性水分。过多的碱对伊红染色不利0.5~1%伊红95%酒精溶液染数秒至数分钟先用自来水洗去
多余伊红染料，再换蒸馏水洗净或95%酒精分色2次至胞质、结缔组织等呈桃红色无水酒精脱水两次（入冬青油数分钟至切片透明，不加胶和盖片
先作镜检，至满意后再入二甲苯透明各数分钟）取出切片，将组织周围多余的二甲苯及颜色擦掉，滴树胶后加盖玻片封固结果：细胞核蓝紫色，胶原
纤维、肌纤维、嗜酸性颗粒桃红色，胞质桃红色，弹性纤维亮桃红色用含重铬酸钾固定液固定的组织，细胞核着色不够鲜艳甲醛长期固定的组织，细
胞核着色困难。需经自来水充分冲洗，用碳酸锂饱和液中和10分钟或更久，才能染色用Susa液、甲酸酒精混合液或Bouin液固定的组织，
染色较好特殊染色法Heidenhain铁苏木精染色法可显示线粒体、染色体、中心体、酶原颗粒、肌原纤维、细胞间桥及张力原纤维方法：⑴
取营养良好的幼年小白鼠组织入Regaud液固定VanGieson染色法⑵切片脱蜡至水⑶Weigert苏木精或其它苏木精深染⑷蒸馏
水速洗多余染料，不必分色⑸VanGieson(VG)液染色1~2分钟（长染对苏木精有褪色作用）VG液：1%酸性品红水溶液10毫升
，苦味酸饱和水溶液90毫升⑹蒸馏水急洗，也可不洗而用吸水纸略吸干⑺95%酒精分色10~30秒⑻无水酒精脱水30~60秒，用吸水纸
吸干⑼二甲苯透明1~2分钟，中性树胶封片结果：胶原纤维品红色，肌纤维黄色，核灰黑色注意：①VG液一次性使用。②酸性品红的量随胶原纤
维染色深浅而加减。③胶原纤维颜色易被碱性自来水褪色，故用蒸馏水洗。④肌肉的黄色易被酒精洗掉，可在95%酒精中加少量苦味酸，切片在酒
精中分色、脱水不宜过久⑤胶原纤维易褪色Mallory三色染色法适于Zenker液、Helly液、Bouin液固定，甲醛思想家的切片
，须经Zenker或Bouin液媒染再染色⑴切片不宜超过8微米⑵切片脱蜡至水⑶0.5%酸性品红水溶液染色5分钟，水急洗⑷Mallo
ry苯胺蓝-橘黄G液染10~20分钟苯胺蓝0.5克，橘黄G2.0克，磷钼酸或磷钨酸1.0克，水100毫升⑸95%酒精分色2次，无
水酒精脱水⑹二甲苯透明，中性树胶封片结果胶原纤维深蓝色；软骨、骨基质、黏液等蓝色，核红色，红细胞橘黄色，肌肉紫红色饱和升汞水溶液：
蒸馏水100毫升加升汞至饱和（约7克多）剧毒，专人保管石炭酸二甲苯：湿度较高的情况下使用HE染色石蜡切片脱水用白色透明结晶石炭酸1
0克与二甲苯30毫升或40毫升配成1：3或1：4混合液Masson三色染色法最适于甲醛升汞液，Bouin液或Zenker液固定的组
织单纯甲醛固定的组织，应在3%升汞或苦味酸酒精液放1小时（加强染色）⑴组织常规脱水，浸蜡包埋，切片8微米内（太厚染色会不均匀）⑵二
甲苯脱蜡，无水酒精洗涤，经各级酒精下行至蒸馏水⑶1%地衣红液染色30~60分钟（弹性纤维）地衣红1克，80%酒精100毫升，盐酸1
毫升⑷蒸馏水洗去多余染料⑸入Weigert苏木精或明矾苏木精染核10~15分钟，充分水洗⑹必要时用0.5%盐酸酒精分色⑺自来水洗，
并浸泡至切片呈蓝色⑻入丽春红品红液染色5~10分钟蒸馏水99毫升，丽春红0.8克，酸性品红0.4克，冰醋酸1毫升依次溶解⑼将切片沾
干⑽经0.5%醋酸水溶液洗30~60秒⑾蒸馏水略洗⑿入1%磷钼酸水溶液分色3~5分钟至胶原纤维呈淡红色或无色，肌纤维红色⒀1%醋酸
水溶液洗30秒⒁入2%亮绿液染色3~5分钟蒸馏水98毫升，亮绿Y2克，冰醋酸2毫升⒂1%醋酸水溶液洗涤⒃95%及无水酒精各1分
钟⒄二甲苯透明，中性树胶封片结果：胶原纤维绿色；弹性纤维棕色至深棕色；肌纤维红色；纤维素红色，红细胞红色；核蓝黑色注意：用醋酸洗时
不能过度，以免染色被洗去；亮绿可用苯胺蓝代替。HeidenhainAZAN（偶氮卡红-苯胺蓝）染色法⑴组织固定于Zenker、H
elly、Bouin、Carnoy液12~24小时⑵流水冲洗，酒精脱水，石蜡包埋切片⑶二甲苯脱蜡，经酒精下行至水⑷1%苯胺（安尼林
）95%酒精溶液30~60分钟⑸95%酒精1分钟⑹入偶氮卡红B或G水溶液染色37℃温箱8~12小时偶氮卡红1克，蒸馏水100毫升用
时取10毫升加蒸馏水90毫升，冰醋酸0.5~1毫升⑺待切片冷却后，蒸馏水略洗⑻0.1~1%苯胺酒精液分色（镜检）至细胞呈深红色，肌
纤维红色、其它纤维无色或微红色⑼速入含1%醋酸95%酒精溶液洗30~60秒，蒸馏水略洗⑽入5%磷钨酸水溶液媒染0.5~3小时，蒸馏
水略洗⑾苯胺蓝橘黄G混合液染色15~30分钟，随时镜检颜色深浅，避免过染。或改用稀释1/4~1/2水溶液染色1~3小时苯胺蓝0.5
克，橘黄G2克，蒸馏水100毫升，冰醋酸8苦味酸，混合，煮沸，冷却，过滤⑿流水冲去多余染液⒀95%酒精分色使苯胺蓝、橘黄G着色分
明⒁无水酒精脱水1~2分钟，二甲苯透明，中性树胶封片结果：胶原纤维蓝色；肌纤维深红色；弹性纤维亮黄色；核红色；红细胞橘黄色此法可染
胰岛和垂体前叶细胞组织细胞和成纤维细胞台盼蓝注射HE染色法常用肠系膜铺片⑴大、小鼠皮下或腹腔注射0.2~0.5%台盼蓝水溶液（2~
3毫升/公斤体重/次，约0.5~1毫升/次），每天注射一次，连续注射3~6天后取材⑵颈部放血杀死动物，连同肠管取下肠系膜，以He
lly液或酒精甲醛醋酸液固定30~60分钟⑶Helly液固定的铺片，流水冲洗1小时，脱汞；酒精甲醛醋酸液固定的铺片，水洗两次，染色⑷入0.5%苏木精染液4~8小时（或37℃温箱1~2小时），流水洗10%苏木精无水酒精100毫升，甘油5毫升。放置数周后使用用时取5~10毫升加蒸馏水至100毫升⑸入2%铁明矾水溶液分色镜检至核蓝色，胞质淡灰蓝色⑹流水充分洗涤并浸泡水中5分钟⑺入0.5%复制伊红酒精溶液或1%荧光桃红水溶液复染3~5分钟⑻95%酒精分色，无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片结果：成纤维细胞和组织细胞核蓝色，胞质灰至灰蓝色浆细胞⑴切片常规脱蜡，各级酒精下行入水⑵入天青Ⅱ伊红液染色30~40分钟0.4%天青Ⅱ水溶液4毫升，0.1%伊红水溶液6毫升，0.2M醋酸1.7毫升，0.2M醋酸钠0.3毫升，丙酮5毫升，蒸馏水25毫升。依次溶解⑶用吸水纸将切片沾干⑷入丙酮-无水酒精混合液分色30秒，镜检至核、质颜色分明⑸吸干切片，二甲苯透明，中性树胶封片结果：浆细胞核深蓝色，核染蓝至灰蓝色，红细胞红色脱灰骨镀银法脱钙剂⑴浓硝酸5毫升，尿素3~5克，蒸馏水100毫升⑵浓硝酸5毫升，甲醛5毫升，甘油5毫升，蒸馏水100毫升⑶三氯醋酸5克，10%甲醛100毫升⑷浓盐酸15毫升，氯化钠175克，蒸馏水1000毫升。用时每200毫升每日加浓盐酸1毫升⑸EDTA15克，蒸馏水100毫升。脱钙15天以上⑴新鲜骨固定于10%甲醛数日或稍久⑵脱钙，充分流水冲洗⑶5%硫酸钠水溶液浸泡12~24小时中和酸⑷流水冲洗过夜⑸正丁醇冬青油透明，浸软蜡，软蜡包埋。⑹切片脱蜡至水⑺蒸馏水洗5~10分钟⑻入1%硝酸银水溶液日光下10~30分钟⑼蒸馏水洗30~60秒⑽入5%硫代硫酸钠水溶液3分钟⑾蒸馏水充分洗涤⑿1%中性红或沙黄水溶液复染，蒸馏水略洗⒀入95%酒精分色及无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片结果：骨质棕黑色，细胞核红色肌梭镀银法小白鼠肋间肌或腓肠肌，1%硝酸银水溶液1~2天 |
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