真菌药敏试验规范化操作真菌亚专业分组与独立真菌工作区域348家三甲综合医院真菌检测现状调研真菌亚专业分组(n=348)有独立真菌工作区域医院
的比例独立真菌工作区域面积28平方米41%59%28%有独立真菌工作区域无独立真菌工作区域72%20平方米20%80%有真菌亚
专业分组无真菌亚专业分组有独立真菌工作区域无独立真菌工作区域数据尚未发表2017年全年真菌检测送检量348家三甲综合医院真菌检测
现状调研真菌检测各项目各数量级送检量的医院比例(n=348)100%7%21%13%15%1万例以上1000-9999例100-9
99例1-100例0例80%27%48%60%54%59%40%40%16%4%23%20%12%18%35%14%13%53%0
%真菌涂片送检量真菌培养送检量真菌药敏送检量真菌血清送检量平均送检量5180702225084592数据尚未发表抗真菌药物分类代表
性药物多烯类两性霉素B唑类（吡咯类）咪唑类第一代咪康唑第二代酮康唑三唑类第三代氟康唑伊曲康唑新一代伏立康唑泊沙康唑嘧啶类胞嘧啶氟胞
嘧啶丙烯胺类特比萘芬棘白菌素类卡泊芬净米卡芬净阿尼芬净真菌药敏试验方法微量肉汤稀释法商品化微量肉汤稀释法–ATBFungus真
菌药敏试条–Sensititre?YeastOne?比色法真菌药敏板浓度梯度法–Etest真菌药敏试条纸片扩散法–Rosco纸
片扩散法CLSI真菌药敏标准文件文件名发布时间中文全名关联文件M27-Ed42017.11酵母菌肉汤稀释法药敏试验标准方法M60M
27-S4酵母菌肉汤稀释法药敏试验参考标准废止M38-A32017.11丝状真菌稀释法药物敏感试验的参考方法M61M44-Ed22
009.08酵母菌纸片扩散药敏试验方法M60M44-S3酵母菌纸片扩散药敏试验抑菌圈判断标准，MIC折点解释标准和质量控制废止M5
1-A2010.05非皮肤来源的丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验方法M61M51-S1丝状真菌纸片扩散法药物敏感试验判读标准和质量控
制废止M57-Ed12016.04建立抗真菌药物流行病学折点的原理和方法M59M59-Ed22018.01抗真菌药物敏感性流行病学
折点M57M60-Ed12017.11酵母菌药敏试验参考标准M27&M44M61-Ed12017.11丝状真菌药物敏感试验标准M3
8&M51EUCAST真菌药敏文件E.DEF7.3.1酵母菌肉汤稀释法E.DEF9.3.1产孢丝状真菌肉汤稀释法ECUAS
T推荐抗真菌药物敏感性日常及扩展的内部质控EUCAST临床折点依据，11个文件EUCAST技术说明，9个文件真菌临床折点V8.1免
费英文版http://www.EUCAST.org/http://www.EUCAST.orgChiCAST官方中文版http:
//www.chicast.org/http://www.chicast.org基本概念最低抑菌浓度MIC抑制菌的生长至特定程度
的最低药物浓度。最低有效浓度MEC（曲霉-棘白菌素）能够导致菌丝形成小的、圆形的、紧凑的菌丝颗粒的最低药物浓度最低杀真菌/致死浓
度MFC从显示完全抑制生长的每个MIC孔中取混悬液转种于琼脂培养基真菌不生长或3~5个菌落生长的最低药物浓度基本概念临床折点C
BP可将菌株分为：敏感，剂量依赖性敏感，中介，耐药或非敏感流行病学界值ECV可区分具有/不具有耐药表型菌群的MIC或纸片法直径可
将菌株分为野生型（WT）与非野生型（NWT）Vs.CBP:仅根据体外数据建立剂量依赖性敏感SDD通过提高剂量来达到高于正常血
药浓度的目的目前抗真菌药物仅用于氟康唑酵母菌微量肉汤稀释法改良培养基含2%葡萄糖的RPMI,0.165mol/LMOPS,p
H7.0含MOPS的酵母氮的基础肉汤（新型隐球菌）菌株传代沙保弱培养基(SDA)或土豆培养基(PDA)，35℃念珠菌24h，隐
球菌48h挑取菌落– 0.5麦氏浊度（1~5×106CFU/ml）接种量– 0.5~2.5×103CFU/ml/0.5~2.
5×105CFU/ml孵育条件– 35℃24h如生长对照孔生长较弱，延长培养至48h微量肉汤稀释法结果判读：两性霉素B：100%
抑制唑类、5-氟胞嘧啶、棘白菌素类：50%抑制酵母菌结果判定-M60丝状真菌肉汤稀释法菌株分类非皮肤霉菌皮肤霉菌培养基0.2%/2
%葡糖RPMI1640,0.165mol/LMOPS,pH7.0±0.1培养条件PDA35℃毛霉目、曲霉48h；镰刀
菌35℃48~72h+25~28℃至7dPDA；燕麦琼脂（仅红色毛癣菌)30℃4~5d至产孢良好接种量0.5×104~
5×104CFU/ml1×103~3×103CFU/ml孵育条件链格孢属30℃；其它35℃。根霉21~26h；镰刀菌属、曲霉
属、申克氏孢子丝菌46~50h赛多孢属70~74h35℃培养至产孢良好丝状真菌悬液制备接种物分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×10
4~5×104CFU/ml诱导产孢大部分菌PDA35±2?C7d或至产孢良好– 毛霉和曲霉48h，镰刀菌属35±2?C48
~72h然后28~30±2?C培养到7天。1ml0.85%盐水，±1滴or0.01ml吐温20，尽量去除菌丝片段。静置3
~5min，取上清转移至无菌管，振荡15s使用光线路径1cm比色杯，测定530nm光密度：曲霉、拟青霉0.09~0.13，
镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢0.15~0.17，链格孢、离蠕孢0.25~~0.3悬液1:50稀释，达到最终要求浓度
的2倍丝状真菌肉汤稀释法结果判读读取生长抑制非皮肤来源皮肤来源两性霉素B100%80%氟康唑、酮康唑氟胞嘧啶50%80%伏立康唑
、伊曲康唑泊沙康唑、雷伏康唑100%80%棘白菌素MEC80%微量肉汤稀释法考虑到气溶胶、溅洒、操作环节等，建议制备菌悬液的工
作在生物安全IIA或IIB级生物安全柜内操作。同时，考虑到丝状真菌的孢子或分生孢子很容易被吹散导致生物安全的危险，操作培养有丝状
真菌的平板等都应该在生物安全柜内进行。！尚未确定丝状真菌的药敏试验临床折点CLSIM59CLSIM59CLSIM59现有C
BP/ECV郭健，吴文娟.http://www.chicast.cn/www.chicast.cn改良微量肉汤稀释法商品化试剂盒
—ATBFungus3选取培养时间不超过4天的纯培养菌落，如培养物不纯应分纯后检测制备2McF菌液将20μl菌悬液加入ATB
F2培养基的安瓿中用无菌吸管轻轻混匀，避免产生气泡在每个杯状凹槽中加入135μl混匀的ATBF2培养基35±2℃环境中MIC
?1 MIC?0.125 MIC?0.06判读结果：念珠菌属24h±2h，新型隐球菌48h±6h16 32
64128 1 24 12 4 81 2 4 80.1250.250.50.060.1250.250.5Con
trolATBFungus3判读规则与生长对照相比生长不减少＝4分生长稍减少＝3分生长明显减少＝2分很微弱生长或管壁周围生长=
1分不生长＝0分唑类药敏易出现拖尾，机读易产生假耐药结果，应进行人工较正24结果判读判分标准得分和生长对照完全一样4比生长对照有
轻微减少3比生长对照有明显减少2非常微弱的生长1无生长0两性霉素B判读两性霉素B：MIC判断为生长完全受抑制的测试杯浓度（得分“0
”的测试杯）难点：有边缘生长现象–AMB:得分1，如:孔0.5和1分别得1分判读得分0的孔，AMB的MIC=2
4 8 160.5 1 2AMB唑类药物判读氟康唑（FCA）,伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC）：拖尾生长，MIC的测试杯得
分可以为“2”、“1”，“0”分得分=1，结果MIC=16ug/ml16 32 64 1281 2 4 8FCA唑类药
物判读拖尾生长现象–在唑类药物孔中的微弱生长(得分 1或2)，易误判为耐药MIC?1 MIC?0.125 M
IC?0.0616 32 64 128 1 24 12 4 812 40F.5CA80.1250.250.5 0.06
0.1250.25ITR VRCControl色原底物微量肉汤稀释法商品化试剂盒-YeastOne加入Alamar蓝蓝色（
阴性）红色（阳性）两性霉素B其它药物29质控允许范围评估实验实验菌株：332株曲霉临床分离株（中国多中心，种属信息明确）AFST：
CLSIM38-A2SensititreYeastOne检测药物：多烯类：两性霉素B(AMB)唑类：伊曲康唑(ITR)，伏
立康唑(VOR)，泊沙康唑(POS)棘白菌素类：卡泊芬净(CAS)、米卡芬净(MF)药敏结果判读标准：CLSIM59流
行病学临界值(EpdimiologicalCut-offValues,ECVs)简易工作折点(WorkingBreak
points，WBPs)LiY,WangH,ZhaoYP,etal.JMicrobiolImmunolInf
ect.2018May17.pii:S1684-1182(18)30106-3实验方法CLSIM59ECVs简易WB
Ps菌种AMBITRVORPOSCAS烟曲霉≤2≤1≤1≤0.5≤0.5黄曲霉≤4≤1≤2≤0.5≤0.5黑曲霉≤2≤4≤2≤2≤
0.25土曲霉≤4≤2≤2≤1≤0.12构巢曲霉≤4≤2≤2≤1≤0.5杂色曲霉≤2≤2≤2≤1≤0.5抗真菌药物敏感(S)体外
耐药(R)CAS≤0.5≥1MF≤0.5≥1ITR≤2≥4VOR≤2≥4POS≤1≥2AMB≤2≥4MIC≤ECV：野生型；
MIC>ECV：非野生型LiY,WangH,ZhaoYP,etal.JMicrobiolImmunolI
nfect.2018May17.pii:S1684-1182(18)30106-3实验结果CLSIM38-A2药敏结
果分布(μg/ml)AMBITRVORPOSCASMFMIC5010.250.50.120.06≤0.008MIC9020.51
0.250.060.015Range0.12-80.03->160.12->160.03-2≤0.008-0.12≤0.008-0
.06测试药物体外抗曲霉敏感性(耐药率)AMBITRVORPOSCASMFECVs(n=307)0.6%0.3%1%00-WBP
s(n=332)1.5%0.9%2.4%0.3%00ECVs——非野生型（non-wildtype）WBPs——体外耐药（in
vitroR）LiY,WangH,ZhaoYP,etal.JMicrobiolImmunolInfect.
2018May17.pii:S1684-1182(18)30106-3实验结果SensititreYeastOnev
s.CLSIM38基本一致性(essentialagreement，EA)AMBITRVORPOSCASMFTotal±
1Dil67.5%72.9%68.7%63.6%58.4%74.7%67.6%±2Dil91.9%88.6%93.1%90.1
%91.0%92.8%91.2%SensititreYeastOnevs.CLSIM38分类一致性(categoric
alagreement,GA)GA：98.5%(327/332)VME：0.6%(2/332)ME：0.9%(3
/332)酵母菌Etest药敏试验方法培养基RPMI1640+2%葡萄糖+3.45%MOPS+1.5%Bacto琼脂，pH7.
0±0.1接种量念珠菌： 0.5McFarland新型隐球菌：1McFarland孵育条件念珠菌 35℃，24~48h新生隐球
菌：35℃，48~72h判读方法两性霉素B：100%抑制氟胞嘧啶：90%抑制唑类：80%抑制卡泊芬净：80%
抑制37念珠菌Etest判读100%抑制80%抑制38丝状真菌Etest方法培养基RPMI1640+2%葡萄糖+3.45%MOPS
+1.5%Bacto琼脂 pH7.0±0.1接种量曲霉： 0.5McFarland镰刀菌和根霉：1McFarland孵育
条件曲霉： 35℃16~24h镰刀菌：35℃24~48h，然后再室温孵育24~48h根霉：16~24h其它：延长孵育，每天观察
至出现抑菌圈判读方法两性霉素B：100%抑制唑类： 80%抑制39烟曲霉Etest结果判读100%抑制80%抑制CLSIM44-
A2酵母菌纸片扩散法培养基MH琼脂+2%葡萄糖+0.5ug/ml美兰，pH7.2~7.4药物25μg氟康唑、1μg伏立康唑、5
μg卡泊芬净菌株传代血琼脂或沙保弱培养基，35±2℃，念珠菌培养24h接种量0.5McFarland（1×106~5×106C
FU/ml）孵育条件35±2℃，20~24h仅在菌落生长不充分时，48h判读判读方法量取菌落明显减少处抑菌圈直径，忽略抑菌圈内少
量菌落生长41CLSIM44-A2酵母菌纸片扩散法读取抑菌环直径mm除两性B读取100%抑制，其它药物读取明显抑制处在抑菌环
内个别细小或等大小的菌落，可忽略不计42酵母菌纸片扩散法折点CLSIM60酵母菌纸片扩散法折点CLSIM60CLSIM5
1-A丝状真菌纸片扩散法适于侵袭性感染丝状真菌–链格孢属、曲霉属、镰刀菌、拟青霉、根霉及其他接合菌、波氏假阿什利霉、多育赛多孢
等不适于皮肤丝状真菌、双向真菌无临床折点，仅有ECV45CLSIM51-A丝状真菌纸片扩散法培养基：不补充钙、镁的MH培养基，p
H7.2~7.4接种物：分生孢子或孢囊孢子菌悬液0.4×106~5×106CFU/ml，重复性好诱导产孢：大部分霉菌PDA35
±2?C7d或至产孢良好，毛霉和曲霉48h，镰刀菌属35±2?C48~72h然后28~30±2?C培养到第7天。使用1cm
比色杯，测定530nm光密度：曲霉、拟青霉0.09~0.13镰刀菌、毛霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢0.15~0.17链格孢、离
蠕孢0.25~~0.346CLSIM51-A丝状真菌纸片扩散法孵育时间：到生长良好–毛霉 16~24h黄曲、黑曲、烟曲24h，
其它曲霉 48h链格孢、离蠕孢、拟青霉、波氏假阿什利霉、多育赛多孢 48~72h除两性霉素B外，判读80%抑制，抑菌圈内轻度拖属
或有菌丝长入抑菌圈，均可忽略CLSIM51-A丝状真菌纸片扩散法黄曲霉48丝状真菌纸片扩散法ECVCLSIM51S1E室内质
控1. 监测药敏试验的重复性和准确度；2. 监测试剂、仪器及实验条件；3. 操作人员练习终点判读质控频率：每批次试验每换一新批号试
剂盒仪器维修/人员变更后CLSIM60什么情况下做真菌药敏试验?—加强多学科合作感染科医生放射医生临床医生微生物学家制药工业病理
学家徐英春BestPracticeRecommendationsforAntifungalSusceptibility
TestingBritishSocietyforMedicalMycologyRoutinetestingofal
lisolatesisunnecessaryunlessperiodicalsurveillanceofsusc
eptibilityisdoneaspartofantifungalstewardshipOnlyisolate
sfromsevereinfection,isolatesthatneedlong-termtherapy,
orisolatesculturedduringantifungaltherapyneedsusceptibili
tytestingIsolatesofCandidaspp.fromsterilesites,orfrompa
tientsnotrespondingtotherapyataminimumshouldhavetheir
susceptibilitytestedagainstfluconazoleIsolatesofAspergillus
fumigatusshouldhavetheirsusceptibilitytestedagainstantif
ungalagents(eg,itraconazoleandvoriconazole)ifantifungaltre
atmentisgivenSchelenzSetal.LancetInfectDis2015;15:461-74.
隐球菌性脑膜炎临床表现：头痛、发热、意识障碍、颅内压升高CSF常规白细胞数轻至中度增加，以淋巴细胞增加为主，糖降低，蛋白增加墨汁
阳性、培养阳性、隐球菌荚膜多糖抗原阳性合格痰，涂片可见大量有隔真菌丝危险因素：F56，肾内科一病房，患者多关节肿痛4年余，水肿1
月余，喘憋、发热入院，诊断为系统性红斑狼疮，狼疮肾炎，ANCA相关性血管炎，肺间质病变，肺部感染，高血压急症镰刀菌免疫内科二病
房，诊断：系统性血管炎 脓（皮肤拭子）中性粒细胞减少患者，可致弥漫性全身性感染，可从皮肤伤口或血培养分离到测序:茄病镰刀菌
Fusarium solaniXXL,GLN镰刀菌也是常见的污染菌注意筛选致病菌红曲菌属（Monascus）常用于食物发酵便培
养可分离，非致病菌真菌药敏报告审核 在对真菌药敏试验报告进行审核时，如发现以下表型应对药敏结果进行复核确认。白念珠菌对所有唑类耐
药；念珠菌属对唑类耐药，而对棘白菌素类敏感；白念珠菌对棘白菌素类耐药；烟曲霉对所有唑类耐药。天然耐药无论药敏结果如何，均应报告为
耐药或不进行药敏试验11thMCM种属两性霉素B氟康唑伊曲康唑伏立康唑泊沙康唑阿尼芬净卡泊芬净米卡芬净念珠菌属白念++++++++++++++++++++++++光滑++++++++++++++++++++克柔++-++++++++++++++++++葡萄牙++++++++++++++++++++近平滑+++++++++++++++++++++热带++++++++++++++++++++++++隐球菌属++++++++++++++---曲霉属+++-++++++++++++++镰刀菌属++-+++++---毛霉菌++---++---双相真菌++++~++++++++++++---以下药物尿中浓度低不报告：伏立康唑、泊沙康唑无可参考折点，仅报告MIC烟曲霉参考EUCAST折点接合菌对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑和棘白菌素类天然耐药，不报告小结选择适合的药敏试验方法后，认真研究相应指南或产品说明书的操作要求，严格执行！注意培养物孵育时间注意不同菌属接种量注意不同菌属药敏孵育时间注意不同药物采用不同检测方法时的判读标准严格质控，质控株检测结果也是培训判读标准的好教材！掌握好何时应该做药敏切勿想当然操作，做错不如不做！ |
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