第三节：制作泡菜并检测亚硝酸盐含量（教案）
一.泡菜制作的原理
1.菌种：乳酸菌。
(1)常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
(2)分布：广泛分布在空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道等处。
(3)代谢类型：异养厌氧型。
(4)生殖方式：二分裂
2.发酵原理：乳酸菌在无氧条件下，将葡萄糖分解为乳酸。
反应式为：C6H12O62C3H6O3＋
备注：
(1)乳酸菌属于原核生物，它是能将糖类分解成乳酸的一类细菌的总称；所以乳酸菌不是一个种群，而是一类生物。
(2)乳酸菌是严格的厌氧型生物，在有氧存在时，无氧呼吸反而会受到抑制。因此家庭利用乳酸菌制作酸奶时，鲜奶在接种乳酸菌后要正好装满瓶子，然后在适宜温度条件下培养。
(3)抗生素能杀死乳酸菌或抑制乳酸菌的生长。
思考1：为什么含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶？
提示因为酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用。抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶。
二.泡菜制作流程
1.制作流程：
2.材料准备：
(1)选择泡菜坛：选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。不合格的泡菜坛容易引起蔬菜腐烂。检查时，可将坛口向上压入水中，看坛内有无渗水现象，也可使用玻璃制作的泡菜坛。(目的：以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂)
(2)选择原料：选择的蔬菜应质地鲜嫩，肉丰富，无虫咬，无烂痕，无斑点。
3.制作过程：
(1)原料处理：将新鲜蔬菜(原因：若放置时间过长，蔬菜中的硝酸盐易被还原成亚硝酸盐，导致亚硝酸盐的含量相对较高)修整、清洗，阳光下晾晒到菜表皮萎蔫时收起，切成条状或片状。
(2)盐水配置：按清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水(食盐用量过高，乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；食盐用量过低，低于10%则会导致杂菌大量繁殖，泡菜腐败)，并将盐水煮沸(煮沸：有两大作用，一是除去水中的氧气，二是杀灭盐水中的其他细菌)冷却(冷却后使用：是为了保证入坛蔬菜表面带入的微生物能够成活)备用。
(3)装坛：将经过预处理的蔬菜混合均匀，装入坛内，装至半坛时，放入调味品(如蒜瓣、生姜及其他香辛料)，继续装至八成满，再徐徐注入配制好的盐水，使其没过全部菜料(目的是创造厌氧环境)，盖好坛盖。
(4)封坛：向坛边沿的水槽中注满水，以保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。
(5)发酵：将封好的坛子，放在室温(温度过高，易滋生杂菌；温度过低，不利于乳酸发酵，则发酵时间会延长)的环境中约15d(发酵时间的长短受室内温度的影响；时间过短，会造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加)，便可制成清脆爽口的泡菜；在发酵过程中要注意经常向水槽中补充水。
三.结果分析、评价及其亚硝酸盐的测定
1.泡菜发酵过程的分析(三个阶段)
在泡菜发酵期间，由于乳酸菌的发酵作用，发酵产物乳酸不断积累，因此可以根据微生物的活动情况和乳酸积累量，将泡菜发酵过程分为三个阶段：
(1)发酵初期：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵，发酵产物为乳酸、乙醇、醋酸和二氧化碳等。由于有较多的CO2产生，气泡会间歇性地从坛沿水槽中放出，使坛内逐渐形成无氧状态。此时泡菜液的含酸量约为0.3%～0.4%，是泡菜初熟阶段，其菜质咸而不酸、有生味。
(2)发酵中期：由于初期乳酸发酵使乳酸不断积累，pH下降，无氧状态形成，乳酸菌开始活跃，并进行同型乳酸发酵。这时乳酸的积累量可达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8。大肠杆菌、腐败菌、酵母菌、霉菌的活动受到抑制(此时期发酵的主要微生物种类为乳酸菌)。这一期间为泡菜完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香，品质最好。
(3)发酵后期：在此期间进行的是同型乳酸发酵，乳酸含量继续增加，可达1.0%以上。当乳酸含量达到1.2%以上时，乳酸菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。此阶段泡菜酸度过高，风味不协调。
从乳酸的含量、泡菜的风味品质来看，在初期发酵的末期和中期发酵阶段，泡菜的乳酸含量为0.4%～0.8%，风味品质最好，因此常以这个阶段作为泡菜的成熟期。
补充：乳酸发酵的类型
①同型乳酸发酵：发酵产物中只有乳酸的发酵类型。
反应式：C6H12O62C3H6O3
②异型乳酸发酵：发酵产物中除乳酸外，还有其他产物，如乙醇、CO2等的发酵类型。
反应式：C6H12O62C2H5OH＋2CO2C6H12O62C3H6O3
2.泡菜腌制过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化分析
发酵时期 乳酸菌数量 乳酸含量 亚硝酸盐含量 发酵初期 少(有O2，乳酸菌活动受抑制) 少 增加(硝酸盐还原菌的作用) 发酵中期 最多(乳酸抑制其他菌活动) 积累、增多、pH下降 下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解) 发酵后期 减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制其活动) 继续增多，pH继续下降 下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制) 变化曲线 注意 亚硝酸盐是硝酸盐还原菌促进硝酸盐还原形成的，而不是硝化细菌氧化氨形成的；开始时，坛内环境有利于硝酸盐还原菌繁殖，这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间延长，乳酸菌大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，同时泡菜中的维生素C、维生素B族、胡萝卜素、微量元素硒等能阻断亚硝酸盐及其亚硝胺的合成，导致泡菜中亚硝酸盐含量不再增加；而产生的亚硝酸盐在乳酸菌等微生物(这些微生物能合成亚硝酸还原酶来降解亚硝酸盐)的作用下被氧化分解，使其含量降低。所以在腌制过程中，要控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。 3.泡菜质量的评价
好泡菜的标准是咸淡适中、酸度适中、亚硝酸盐含量低，所以制作泡菜时要利用亚硝酸盐含量低的新鲜蔬菜。发酵的不同时期亚硝酸盐的含量会因微生物活动强弱而发生变化，所以应及时检测亚硝酸盐的含量。
4.亚硝酸盐含量的检测
(1)亚硝酸盐物理性质 白色粉末易溶于水 应用 在食品生产中常用作食品添加剂 分布 分布广泛存在于蔬菜、咸菜和豆粉等食品中 危害 人体摄入总量达到0.3～0.5_g时会引起中毒；摄入总量达到3_g时会引起死亡我国食品卫生标准 肉制品中不得超过30_mg/kg酱腌菜中不超过20mg/kg婴儿奶粉中不得超过2_mg/kg 代谢 绝大随尿排出但在特定条件下即适宜的pH、温度和一定的微生物作用下会转变为致癌物——亚硝胺2+氧化为Fe3+，使低价铁血红蛋白氧化为高价铁血红蛋白，并阻止氧合血红蛋白释放氧气，致使组织缺氧，出现全身青紫而中毒，同时还会导致血管扩张和血压降低，从而出现中毒症状。 (2)亚硝酸盐含量的测定原理：在盐酸酸化条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。方法：比色法。通过将待测溶液和试剂反应后的样品与标准显色液作比较得出待测溶液的亚硝酸盐含量。测定操作：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。 具体操作 配制溶液 ①配置质量浓度为4mg/mL的对氨基苯磺酸溶液：称取0.4g对氨基苯磺酸，溶解于100mL体积分数为20%的中，避光保存。
2mg/mLN-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液：称取0.2gN-1-萘基乙二胺盐酸盐，溶解于100mL水中，保存。
5μ/mL亚硝酸钠溶液称取0.10g于中干燥24h的亚硝酸钠，用水溶解并定容至500mL，再转移5mL溶液至200mL容量瓶中，定容至200mL。
提取剂称取50g和50g溶解于1000mL蒸馏水中，用盐酸调节pH至1。氢氧化铝乳液和物质的量浓度为2.5mol/L的溶液。制备标准显色液 μ/mL亚硝酸钠溶液0.40mL、0.6、0.80、1.00、1.50mL(空白对照)
②在各比色管中分别加入2.0mL对氨基苯磺酸溶液，混匀，静置3~5min；
③向各比色管加入1.0mLN-1-萘基乙二胺盐酸盐溶液
④观察亚硝酸钠溶液颜色的梯度变化 制备样品处理液
①称量、榨汁：称取0.4kg泡菜，粉碎，过滤后得到约200mL汁液。
③吸附、脱色：取②中所得滤液60mL转移至100mL容量瓶中，加入氢氧化铝乳液，定容至100mL，过滤。此时，滤液变得无色透明；
备注：每次取样要用洗净的筷子、小匙，专人专用，专人清洗。取样后迅速封坛，防止泡菜被污染。 比色
②分别依次加入2.0mL的对氨基苯磺酸溶液和1.0mL的N-1-萘基乙二胺盐酸盐(比色过程中，由于重氮化反应不稳定，显色后溶液颜色会不断加深，所以时间控制在静置15min后比色较好)；
③观察样品颜色的变化，并与标准显色液比较，找出与标准显色液最相近的颜色，记录对应的亚硝酸钠含量，并按照下面的公式进行计算：
亚硝酸盐含量＝
腌制天数
1号坛
2号坛
3号坛
封坛前
第2天
第4天
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备注：
★测定实验中所用试剂、药品及其作用
序号 试剂、药品 作用 1 对氨基苯磺酸 与亚硝酸盐发生重氮化反应 2 盐酸 调节pH成酸性 3 N-1-萘基乙二胺盐酸盐 与重氮化反应的产物结合，生成玫瑰红色染料，作为测定亚硝酸盐含量的指示剂 4 硅胶 干燥剂，用于干燥亚硝酸钠 5 干燥后的亚硝酸钠 制备相应浓度的标准显色液 6 氯化镉、氯化钡 溶于蒸馏水并用浓盐酸酸化后作为亚硝酸盐的提取剂 7 氢氧化钠 中和过多的盐酸，营造碱性环境 8 氢氧化铝 作为吸附剂，使泡菜滤液脱色，变澄清配制的亚硝酸盐标准显色液与样品处理液显色后，根据颜色深浅程度判断样品处理液是否与标准显色液的浓度相吻合。如果不吻合，还应在已知浓度范围内，改变浓度梯度，进一步配制标准显色液。
结果分析
a：AB段：坛内环境有利于硝酸盐还原菌的繁殖将硝酸盐还原为亚硝酸盐亚硝酸盐含量增加。BC段：由于乳酸菌的大量繁殖产生乳酸对硝酸盐还原菌产生抑制作用同时形成的亚硝酸盐又被分解亚硝酸盐含量下降。
提示：形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
思考3：有人说：“‘千沸水’喝不得，长期饮用会导致癌症。”请分析其道理。
提示：水中本含有少量硝酸盐和亚硝酸盐，在烧水过程中硝酸盐不断分解，导致亚硝酸盐不断上升。
思考4：在泡菜发酵过程中只有乳酸菌在活动吗？
提示：有多种微生物在活动，如酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌等。
思考5：在泡菜制作过程中，为什么要测定亚硝酸盐的含量？
提示：测定亚硝酸盐含量的目的是掌握取食泡菜的时机。
思考6：泡菜制作中营造“无氧环境”的措施哪些？选择的泡菜坛要密封性好；②加入蔬菜后要注入煮沸冷却的盐水，使盐水没过全部菜料；
盖上坛盖后要
思考7：泡菜发酵时间越长越好？泡菜发酵时间并非越长越好；泡菜的发酵时间长，亚硝酸盐含量低，但是发酵时间过长会产生其他有害物质。泡菜发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。
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