附件
辣椒制品中苏丹红的快速检测胶体金免疫层析法
范围
本方法规定了中苏丹红I快速检测方法。
本方法适用辣椒酱、辣椒油、辣椒粉中苏丹红I的快速测定。
原理
本方法采用竞争抑制免疫层析原理。样品中的苏丹红I与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中苏丹红I进行定性判定。
试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的二级水。
试剂
乙腈。
无水硫酸镁。
正己烷。
二氯甲烷。
氢氧化钠
氢氧化钠溶液（2mol/L）：称取氢氧化钠（3.1.5）8g，用水溶解并稀释至100mL。
无水乙醇。
复溶液
参考物质
苏丹红参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量见表1，纯度≥95%。
表1苏丹红参考物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量
中文名称 英文名称 CAS登录号 分子式 相对分子量 苏丹红 SudanI 842-07-9 C16H12N2O 248.28 注：或等同可溯源物质。
标准溶液的配制
苏丹红标准储备液（1mg/mL）：精密称取苏丹红标准品（3.2.1）适量，置于10mL容量瓶中，乙腈（3.1.1）溶解稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1mg/mL的苏丹红Ⅰ标准储备液。-20℃避光保存，有效期6个月。
苏丹红标准中间液（1μg/mL）：精密量取苏丹红标准储备液（1mg/mL）（3.3.1）100μL，置于100mL容量瓶中，用乙腈（3.1.）稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1μg/mL的苏丹红标准中间液。
材料
固相萃取柱：200mg/3mL），或相当者。
苏丹红胶体金免疫试剂盒，适用基质为辣椒酱、辣椒油、辣椒粉。
金标微孔。
试纸条或检测卡。
仪器和设备
μL、1mL和5mL。
涡旋混合器。
离心机：转速≥4000r/min。
电子天平：感量为0.01g。
氮吹仪。
水浴锅。
环境条件：温度15℃～35℃，湿度≤80%。
分析步骤
试样制备
。
试样的提取
5.2.1辣椒酱
称取辣椒酱2g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入0.5g无水硫酸镁（3.1.2）和5mL正己烷（3.1.3）提取液，涡旋振荡1min后，4000r/min离心5min。将上清液加入到固相萃取柱（3.）中，。再加入mL正己烷固相萃取柱，流出液弃去。2mL二氯甲烷（3.1.4）洗脱固相萃取柱，吹干。加入00μL复溶液（3.1.），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
5.2.2辣椒油
称取辣椒油5g（精确至0.01g）于15mL离心管中，加入8mL正己烷（3.1.3）进行提取，涡旋振荡1min后，将上清液加入到固相萃取柱中，。再加入mL正己烷固相萃取柱。2mL二氯甲烷固相萃取柱，吹干。加入00μL复溶液（3.1.），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
5.2.3辣椒粉
称取辣椒粉3g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入8mL乙腈（3.1.1）提取，涡旋振荡1min后，6000r/min离心5min。转移上清液于10mL离心管中，加入2mL氢氧化钠溶液（3.1.6），涡旋混匀30s后置于80℃水浴皂化5min。再加入2mL正己烷（3.1.3），涡旋萃取30s后，6000r/min离心5min，转移上清液于新的10mL离心管中无水硫酸镁（3.1.2）0.5g，涡旋振荡30s后，4000r/min离心5min，上清液于10mL离心管中吹干。精密加入00μL复溶液（3.1.），涡旋混合1min，作为待测液，立即测定。
测定步骤
μL待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，温育5～8min，从微孔中取出试纸条，进行结果判定。
检测卡与金标微孔测定步骤
吸取200μL待测液于金标微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3～5min，将金标微孔中全部溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，温育5～8min，进行结果判定。
质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
加标质控试验
准确称取空白试样（精确至0.01g）置于具塞离心管中，加入一定体积的苏丹红I标准中间液（3.3.2），使苏丹红I添加浓度为10μg/kg，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
结果判定
通过对比控制线（C线）和检测线（T线）的颜色深浅进行结果判定。目视判定示意图见图1。
无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
阴性
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中苏丹红低于方法检测限，判定为阴性。
阳性
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中苏丹红的含量高于方法检测限，判定为阳性。
质控试验要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
a)试纸条
b)检测卡
图1目视判定示意图
结论
当检测结果为阳性时，应对结果进行确证。
性能指标
μg/kg。
灵敏度：灵敏度应≥99%
特异性：特异性应≥85%。
假阴性率：假阴性率应≤1%。
假阳性率：假阳性率应≤15%。
注：性能指标计算方法见附录A。
其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为标准为GB/T19681-2005《食品中苏丹红染料的检测方法高效液相色谱法》。
附录A
定性方法性能计算表
表A.1性能指标计算方法
样品情况a 检测结果b 总数 阳性 阴性 阳性 N11 N12 N1.=N11+N12 阴性 N21 N22 N2.=N21+N22 总数 N.1=N11+N12 N.2=N21+N22 N=N1.+N2.或N.1+N.2 显著性差异(х2) (2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),
自由度（df）=1 灵敏度（p+，%） p+=N11/N1. 特异性（p-，%） p-=N22/N2. 假阴性率（pf-，%） pf-=N12/N1.=100-灵敏度 假阳性率（pf+，%） pf+=N21/N2.=100-特异性 相对准确度，%c （N11+N22）/(N1.+N2.) 注：
a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果；
b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。
N：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
C为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。
本方法负责起草单位：。
验证单位：山东省食品药品检验研究院中国农业科学院油料作物研究所。
主要起草人：熊晓辉，汪开银，，王督
—1—
|
|
