常见的荧光染料（FITC/ICG/Cy/PE）标记抗体及影响多色分析的三大因素在进行流式细胞仪多色分析时，如果想得到理想的分析结果，就需要选
择好抗体的荧光搭配。常考虑的影响因素有以下几点。1荧光素的荧光强度一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，取决于该抗体用何种荧光素
标记。每一种荧光素的光量子释放能力不同，相对荧光强度不一样，一般用染色指数（stainingindex）来比较不同荧光标记的光信
号强度。染色指数是阳性信号和阴性信号差异与阴性峰分布宽度比值，是判断该荧光染料辨别弱阳性表达的能力。如下图显示了用8种不同的荧光素
标记相同的单克隆抗体，得到了不同的染色结果，我们需要从中寻找染色指数较高的荧光染料，去标记表达弱的信号。由此可以看出：对于特定的单
克隆抗体，由于使用了不同的荧光素标记，其阴性细胞核阳性细胞的S/N比值（信噪比）可以相差4-6倍。一般来讲，荧光信号由强到弱的的排
序是：PE>APC>PE-CY5>PERCP-CY5.5>FITC>PERCP。在选择荧光标记抗体时，需要综合以下方面的因素：荧光
素标记效率：抗体上标记荧光素的数量（F/P）值也会影响相对荧光强度。每一个抗体上可标记几个FITC或PERCP分子（通常为2-9个
），而APC和PE的标记量约为每个抗体标记一个荧光分子。FITC为小分子化合物，而PE，PERCP和APC则是分子量较大的荧光蛋白
。受荧光标记物的化学性质要求限制，IGM型抗体通常只用小分子的荧光素进行标记，如FITC、TEXASRED、CY3和CY5。抗体
检测的抗原密度：高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素标记的抗体检测，从而
达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。细胞自发荧光：每个细胞群体的自发荧光水平都不同，尽管可以观察到高荧光强度的细胞，但自发荧光
在高波长范围里（>600nm）迅速降低。检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料比如APC可以得到较好的S/N比值
。如果是自发荧光水平不太高的细胞，那么，使用较长波长的激发光激发，对于提高阳性、阴性差别的现象影响不明显。可以使用FITC标记的抗
体。2非特异性结合有些荧光标记的抗体会表现出低水平的非特异性结合，就会造成阴性细胞的荧光水平升高。这种非特异性结合通常由以下两种
因素造成：单克隆抗体的同型对照：一些IGG型同型对照更易于某些类型的细胞的FC受体结合使用的荧光素：有时CY3，CY5，CY5.5
和TexasRed直接标记的抗体，以及某些tandom偶联抗体，与某些细胞亚群的结合性增强。对于CY5来说，研究表明，这主要是由
于染料与低亲和性FC受体的弱相互作用造成的；PE-CY5标记的抗体也有类似作用。另外，在某些情况下（如用抗HLA-DGPE/抗单
核细胞PerCP-CY5.5分析单核细胞），也可以利用这种特性，有意在标记抗体是增加CY染料的标记量，这样就可以保证无论每个单核细
胞的CD14表达水平的高低差别有多少，都可以检测到单核细胞总之，在进行流式细胞仪多色分析时，应慎重选择荧光抗体标记的荧光染料。主要
影响因素有：根据不同型号选择适当的荧光抗体（激光功率和波长）；染色细胞的抗原表达的相对密度（对于低表达密度的抗原，应该选择更亮的荧
光染料）；阴性细胞上的FC受体情况。此外，做多色分析时，要尽量选择荧光波普间的光谱重叠较小的荧光染料进行组合，同时需要正确的调整补
偿。3.荧光补偿的调节当细胞携带两种或者以上荧光素（比如PE和FITC），受激光激发而发射两种以上不同波长的荧光时，理论上可选择滤
片使每种荧光仅被相应的检测器检测到，而不会检测到另外一种荧光。但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽发射谱性质，虽然他们之间各自发射
的峰值不相同，但发射谱范围有一定的重叠，因而少量不需要检测的另一种荧光信号也会被此光电倍增管所检测，所以每一个光电倍增管实际上检测
到都是两种荧光之和，但各以某一种荧光为主。如图可以看出，荧光素的发射波谱有一定范围，其发射信号势必会有极少部分进入到另一个检测当中
。图中阴影为探测器检测光谱的范围，FITC探测器会检测到少量的PE光谱，而PE光谱探测器检测到较多的FITC光谱。由于光谱重叠的部
分占检测信号的一定比例，因此，荧光补偿的方法就是：从所接收的荧光信号中，把另一个检测器中接收信号的一部分（即光谱重叠的部分）减去，
使另一个检测器信号在此检测器中检测的信号与阴性背景信号一致，这样，该光电倍增管中输出的信号真正只代表指定检测的信号，而没有另一波长
的荧光信号的干扰。利用标准的已知单阳性样本，可合理设置荧光信号的补偿值。补偿的程度可用双荧光参数同时测定的仪器条件来决定。补偿时先
测定一种染料的荧光（FL1），此时除了应该接收该荧光的光电倍增管如FL1检测器有信号输出外，另一光电倍增管FL2检测器也常会有微弱
的输出，调节补偿器FL2-%1FL1，使FL2检测器输出的平均荧光强度与阴性信号一致；然后再测另一种染料（FL2），再调整补偿器F
L1-%FL2，使FL1检测器输出的平均荧光强度与阴性信号一致。如此反复调节，则FL1和FL2检测器就可全获补偿。做多色分析时，必
须分别使用各个荧光素单阳性的样本做检测，调整与其他各荧光通道的补偿，以保证多色分析结果的准确性。由于多色分析荧光补偿的复杂性，许多
分析软件都允许做脱机补偿，这为操作者提供了很大的方便。需要注意的是，补偿与特定实验的特定荧光素组合、特定仪器条件设置有关。当补偿设定之后，如果PMT的电压改变、激光波长变动、滤光片系统等有变化，荧光补偿值就会有改变，需要重新调整补偿。 |
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