第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具[学习目标] 1.说出DNA重组技术所需的三种基本工具的作用。2.清楚基因工程的载体需要具备的条
件。3.概述DNA粗提取与鉴定的原理、过程。知识自主梳理转基因 DNA分子 重组DNA技术 原核生物 特定核苷酸序列 磷酸二酯键
6个核苷酸 黏性末端 平末端 磷酸二酯键 大肠杆菌 黏性末端 两种 平末端 磷酸二酯键 运输 大量复制 质粒 噬菌体、动植物病毒
原核细胞拟核DNA 自我复制 环状 有一个至多个限制酶切割位点 自我复制 随受体DNA同步复制 标记基因 筛选 RNA 物理和化学
酒精 酒精 2 mol/L 一定温度 二苯胺 二苯胺 10 4 ℃ 上清液 1500 上清液 上清液 体积相等 预冷 白色丝状物
沿一个方向 10000 沉淀物 2 mol/L 二苯胺 沸水 基因工程操作导致的基因重组与有性生殖中的基因重组的主要区别是什
么？提示：①有性生殖中的基因重组是随机的，并且只能在同一物种间进行；②基因工程可以在不同物种间进行重组，并且方向性强，可以定向地改
变生物的性状。 原核生物体内的限制酶不切割自身DNA的原因？提示：原核生物的DNA中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
病毒为什么可以作为基因工程的载体？提示：因病毒能够侵染正常细胞，有的病毒还能将自己的核酸整合到宿主细胞的染色体上，所以病毒也可作
为基因工程的载体。 可否选用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料？为什么？提示：不可以。哺乳动物成熟的红细胞内没有细胞核和各种复杂的
细胞器，不含有DNA。 提纯时，为什么要选用体积分数为95%的冷酒精？提示：预冷的酒精溶液具有以下优点：一是可抑制核酸水解酶的活
性，防止DNA降解；二是降低分子运动，使DNA易形成沉淀析出；三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少断裂。学习目标检测1．(目
标1)在基因工程中，科学家所用的“剪刀”“针线”和“常用载体”分别是指( )A．大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶B．噬菌体、质粒
、DNA连接酶C．限制酶、RNA连接酶、质粒D．限制酶、DNA连接酶、质粒2．(目标1)下列黏性末端属于同一种限制酶切割而成的是(
)A．①② B．②③ C．①④ D．①③3．(目标1)下列关于各种与基因工程有关酶的叙述，不正确的是( )A．DNA连接
酶只能连接黏性末端B．限制酶主要从原核生物中分离纯化出来C．目的基因的载体上至少有一个限制性内切核酸酶的切割位点D．逆转录酶以脱氧
核糖核苷酸为原料，以RNA为模板合成互补DNA4．(目标2)下列一般不作为基因工程中载体上的标记基因的是( )A．抗性基因B．发
光基因C．产物具有颜色反应的基因D．贮藏蛋白的基因5．(多选)(目标3)多种实验材料都可以用于DNA的粗提取与鉴定，用香蕉也可以取
得较好的实验效果，下列操作正确的是( )A．向剪碎的香蕉果肉组织中加入蒸馏水并研磨，以释放核DNAB．经研磨过滤后，将研磨液离心
5分钟，取上清液进行下一步操作C．冷却的体积分数为95%的酒精可以溶解某些蛋白质，得到粗提取的DNAD．将DNA溶于NaCl溶液后
，加入现配的二苯胺试剂，混合均匀即可出现蓝色解析 向剪碎的组织中加入的是研磨液，可以起到使蛋白质和DNA分离，保护并溶解DNA的作
用，A错误；DNA不溶于酒精，因此可用体积分数为95%的冷酒精溶解某些蛋白质析出DNA，获得较纯净的DNA，C正确；在沸水中，DN
A遇二苯胺会出现蓝色反应，D错误。重点题型突破题型一 几种酶的比较[例1] 下列关于几种酶作用的叙述，不正确的是( )A．DNA
连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合，催化遗传信息的转录C．一种限制酶能识别多种核苷
酸序列，并切割出多种目的基因D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链解题分析 DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷
酸与脱氧核糖连接形成磷酸二酯键，A正确；RNA聚合酶能与基因的特定位点(启动子)结合，催化遗传信息的转录，B正确；一种限制酶只能特
异性地识别一种核苷酸序列，体现了酶的专一性，C错误；DNA分子复制时，DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接到DNA单链末端，形成
一条DNA单链，D正确。几种酶的比较题型二 限制酶识别序列特点[例2] (多选)下列关于如图所示黏性末端的说法错误的是( )A．
甲、乙、丙黏性末端是由相同的限制性内切核酸酶催化产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能C．DN
A连接酶作用位点在b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键D．切割甲的限制性内切核酸酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子题
型二 限制酶识别序列特点[例2] (多选)下列关于如图所示黏性末端的说法错误的是( )A．甲、乙、丙黏性末端是由相同的限制性内切
核酸酶催化产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能C．DNA连接酶作用位点在b处，催化磷酸基团和
脱氧核糖之间形成化学键D．切割甲的限制性内切核酸酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNA分子解题分析 三种限制酶识别的碱基序列不同，
故限制酶种类也不同，A错误；三个末端中甲、乙的碱基可互补配对，故二者可形成重组DNA分子，该重组DNA分子不具有切割甲的限制性内切
核酸酶识别的碱基序列，故不能被切割甲的限制性内切核酸酶识别切割，B、D正确；b处表示氢键，而DNA连接酶的作用是使两个DNA片段之
间的磷酸二酯键连接起来形成一个DNA分子，C错误。判断两个黏性末端是否为同一种限制酶切割产生的：一看游离碱基能否相互配对；二看两条
链上的切点是否相同。技巧：将其中一个黏性末端旋转180°，若完全相同，则说明这两个黏性末端是由同一种限制酶切割产生的。题型三 载体
种类和条件[例3] 质粒是基因工程最常用的载体，下列关于质粒的说法正确的是( )A．质粒在宿主细胞内都要整合到染色体DNA上B．
质粒是独立于细菌拟核DNA之外的小型细胞器C．基因工程使用的质粒一般含有标记基因和一个至多个限制酶识别位点D．质粒上碱基之间数量存
在A＋G＝U＋C解题分析 质粒进入宿主细胞后不一定都要整合到染色体DNA上，如宿主细胞是细菌细胞则不需整合，A错误；质粒是小型环状
双链DNA分子而不是细胞器，有的真核细胞中也含有，也不会有碱基U，B、D错误。[例4] 在基因工程中使用的载体有很多种类型，其中有
一种穿梭载体，它不仅具有细菌质粒的复制原点，还有真核细胞的自主复制序列，在细菌中主要用于克隆和扩增目的基因，在酵母菌中主要用于基因
表达分析。下列相关叙述错误的是( )A．穿梭载体在细菌和酵母菌中都能够复制B．穿梭载体中通常插入抗生素合成基因，便于进行目的基因
的筛选C．在细菌中进行克隆利用了细菌生理结构简单、生长繁殖快的优点D．在酵母菌中的基因表达产物可被酵母菌中相应的细胞器进行修饰加工
解题分析 根据题意可知，穿梭载体，它不仅具有细菌质粒的复制原点，还有真核细胞的自主复制序列，因此穿梭载体在细菌和酵母菌中都能够复制
，A正确；穿梭载体中通常插入抗生素抗性基因，作为标记基因便于进行目的基因的筛选，B错误；细菌作为原核细胞，细胞结构简单，繁殖速度快
，因此在细菌中进行克隆和扩增目的基因，利用了细菌生理结构简单、生长繁殖快的优点，C正确；酵母菌属于真核细胞生物，具有多种细胞器，在
酵母菌中的基因表达产物可被酵母菌中相应的细胞器进行修饰加工，如分泌蛋白可以被内质网和高尔基体进行加工，D正确。基因工程中常用的载体
有质粒、动植物病毒、噬菌体等。质粒与载体的关系：一方面，质粒是基因工程中最常用的载体，但载体并不都是质粒；另一方面，并非所有的质粒
均适合作为载体，有许多质粒未必完全符合作为载体的条件(如没有合适的标记基因等)。基因工程中所使用的质粒载体都是经过人工改造的。题型
四 “DNA的粗提取与鉴定”实验的原理及操作[例5] 关于“DNA的粗提取与鉴定”的实验，下列哪项不是该实验依据的实验原理( )
A．DNA在NaCl溶液中的溶解度，随着NaCl溶液浓度的不同而不同B．利用DNA不溶于酒精的原理，可除去细胞中溶于酒精的物质C．
DNA可以被碱性染料染色D．在沸水中DNA与二苯胺反应会呈现蓝色解题分析 染色体可以被碱性染料染色，C错误。[例6] 下列有关“D
NA的粗提取与鉴定”实验相关操作中所选取的试剂，错误的是( )解题分析 2 mol/L的NaCl溶液能溶解核内DNA,0.14
mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度最低。课后课时作业[单项选择题] 知识点一 基因工程概念及工具1．下列叙述符合基因工程概
念的是( )A．加热杀死的S型细菌和活的R型细菌一起培养得到活的S型细菌B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生
人干扰素的菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其D
NA整合到细菌DNA上解析 基因工程又叫DNA重组技术，是一种人为的操作过程。A项属于基因重组，但由于S型细菌的基因不是人为导入R
型细菌的，故不属于基因工程的范畴，不符合题意；B项符合基因工程的概念，符合题意；C项属于诱变育种，不符合题意；D项外源基因导入细菌
不是人为操作的，不属于基因工程的范畴，不符合题意。2．下列有关基因工程中限制性内切核酸酶的描述，正确的是( )A．限制性内切核酸
酶只能识别6个或8个脱氧核苷酸组成的序列B．限制性内切核酸酶的活性受温度的影响C．限制性内切核酸酶能识别和切割RNAD．限制性内切
核酸酶只能从原核生物中提取解析 限制性内切核酸酶能够识别并切割双链DNA上特定的核苷酸序列，大多数限制性内切核酸酶能够识别6个核苷
酸组成的序列，少数可以识别4个、8个或其他数量的核苷酸组成的序列，A错误；限制性内切核酸酶的化学本质是蛋白质，活性受温度影响，B正
确；限制性内切核酸酶只能识别和切割DNA，C错误；限制性内切核酸酶主要从原核生物中获得，D错误。3．我国华南农业大学科研人员利用农
杆菌转化法将抗环斑病毒基因导入番木瓜，培育出转基因抗病番木瓜。下列叙述错误的是( )A．限制酶在Ti质粒切开一个切口暴露出两个游
离的磷酸基团B．不同的限制酶切割DNA产生的黏性末端一定不同C．可以用同种限制酶切割Ti质粒和含有抗环斑病毒基因的DNA片段D．T
4 DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端解析 限制酶可以识别特定的DNA序列并在特定位点进行切割，将双链DNA切开，故限制
酶在Ti质粒切开一个切口暴露出两个游离的磷酸基团，A正确；不同的限制酶切割形成的黏性末端也可能相同，也可能不同，B错误；可以用同种
限制酶切割Ti质粒(载体)和含有抗环斑病毒基因(目的基因)的DNA片段，以形成相同的黏性末端，便于连接，C正确；T4 DNA连接酶
既能连接黏性末端，又能连接平末端，只是连接平末端的效率较低，D正确。4．如图为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示
限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )A．①②③④ B．①②④③C．①④②③ D．①④③②解析 限
制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，因此①符合；DNA聚合酶
用于DNA分子的复制，能将单个脱氧核苷酸连接到DNA单链末端，因此④符合；DNA连接酶能在具有相同末端的两个DNA片段之间形成磷酸
二酯键，将切开的双链DNA片段“缝合”起来，因此②符合；解旋酶能够将DNA分子的双螺旋解开形成单链，因此③符合，C正确。5．下列有
关细菌质粒的叙述，正确的是( )A．质粒是存在于细菌细胞中的一种颗粒状的细胞器B．质粒是细菌细胞中能自我复制的小型环状DNA分子
C．质粒只有在进入受体细胞后在宿主细胞内才能复制D．细菌质粒的复制过程一定是在受体细胞外独立进行解析 质粒是原核生物或真核生物细胞
质中能自主复制的小型环状DNA分子，不是细胞器，在受体细胞内外均可复制，A、C、D错误，B正确。6．质粒是基因工程最常用的载体，下
列有关质粒的说法错误的是( )A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B．质粒作为载体时，应具有标记基因和一至多个限制酶切点C．
有的质粒可将目的基因整合到染色体DNA上D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制解析 质粒存在于细菌和某些真核生物中，
病毒中不具有，A错误。7．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是5′—C↓TTAAG—3′和5′—G↓AATT
C—3′。如图表示四种质粒和目的基因，其中，质粒上箭头所指部位为酶的识别位点，阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒
是( )解析 用限制酶MunⅠ切割A质粒后，不会破坏标记基因，而且还能产生与目的基因两侧黏性末端相同的末端，适于作为目的基因的载
体，A正确；B项中质粒没有标记基因，不适于作为目的基因的载体，B错误；C、D质粒含有标记基因，但用限制酶切割后，标记基因会被破坏，
因此不适于作为目的基因的载体，C、D错误。 知识点二 DNA的粗提取与鉴定8．下列有关DNA的粗提取的叙述，错误的是( )A．洋
葱研磨液过滤在1500 r/min的转速下离心5 min后，取上清液进行实验B．在上清液中加入体积分数为95%的冷酒精，溶液中出现
的丝状物是粗提取的DNAC．在DNA粗提取过程中玻璃棒搅拌方向不需要一致D．在DNA粗提取过程中，用冷酒精处理的上清液，可在100
00 r/min的转速下离心5 min，收集管底的沉淀物9．甲、乙两图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置图。下列相
关叙述正确的是( )A．图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂均为NaCl溶液，但两者浓度不同B．图乙试管经沸水浴后即可观察到两支试管
中的溶液均变蓝，但颜色深浅程度不同C．图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA成为絮状沉淀并缠绕在玻璃棒上D．图乙操作中所用的二苯胺试
剂需现配现用以达到较好的鉴定效果解析 图甲的烧杯中所用的溶液是冷却的体积分数为95%的酒精，A错误；图乙试管经沸水浴后即可观察到一
支试管中的溶液(含有DNA)明显变蓝，另一支试管中的溶液(不含DNA)不变蓝，B错误；图甲操作需用玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌以卷起丝
状DNA，C错误；图乙操作中所用的二苯胺试剂需现配现用以达到较好的鉴定效果，D正确。[多项选择题]10．下面是4种限制酶所识别的D
NA分子序列和切割位点图(↓表示切割位点，切口为黏性末端)：限制酶1：—↓GATC—限制酶2：—CATG↓—限制酶3：—G↓GAT
CC—限制酶4：—CCGC↓GG—请指出下列哪组表达不正确( )A．限制酶1和3切出的黏性末端相同B．限制酶1、2、4识别的序列
都由4个脱氧核苷酸组成C．在使用限制酶的同时还需要解旋酶D．限制酶1和2切出的DNA片段可通过T4DNA连接酶拼接11．下图表示一
项重要的生物技术，对图中物质a、b、c、d的描述，不正确的是( )A．通常情况下，a与d需要用同一种限制酶进行切割B．b能识别特
定的核苷酸序列，并将A与T之间的氢键切开C．c连接双链间的A和T，使黏性末端处碱基互补配对D．b代表的是限制性内切核酸酶，c代表的
是RNA聚合酶解析 b是限制性内切核酸酶，能识别特定的核苷酸序列并使DNA分子的每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开
，而不是使氢键断开，c是DNA连接酶，能连接两个DNA片段中的磷酸二酯键，B、C、D错误。[非选择题]12．如图为大肠杆菌及质粒载
体的结构模式图，据图回答下列问题。DNA 能够自我复制 具有遗传效应 DNA连接酶 标记基因 便于重组DNA分子的筛选 (4)下列
常在基因工程中用作载体的是( )A．苏云金芽孢杆菌的抗虫基因B．土壤农杆菌中的RNA分子C．大肠杆菌的质粒D．动物细胞的染色体C
13．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动,具体步骤如下：材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎
后分成两组，并分别置于20 ℃和－20 ℃条件下保存24 h。DNA的粗提取：第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研
磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒
精，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。第三步：取6支试管，分别加入等量的物质的量浓度为2 mol/L的Na
Cl溶液溶解上述絮状物。DNA的检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较
溶液的颜色深浅，结果如表所示。注：“＋”越多表示蓝色越深。分析上述实验过程，回答下列问题：(1)该探究性实验的课题名称是_____
_____________________________ ________________。(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为
了减少____________________。(3)根据实验结果，得出结论并分析：①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20
℃条件下保存，DNA的提取量较多。结论2：___________________________________________
__________ __________________。②针对结论1，请给出合理的解释：___________________
__________ _______________。探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响DNA分子的断裂 等质量的不同
实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是_____________________________ ______________________________________________，然后用体积分数为95%的冷酒精使DNA析出。将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液解析 (1)从表格可以看出，该实验有两个自变量：材料和温度，所以该探究性实验的课题名称为探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。(2)第二步中用玻璃棒搅拌的目的是获取DNA絮状物，所以若搅拌速度快，易造成DNA分子的断裂。(3)本实验的结论可从两个方面来考虑：①相同材料在不同保存温度下的结论；②不同材料在相同保存温度下的结论。(4)氯仿能使蛋白质变性沉淀，而对DNA影响极小，所以可将第三步获得的溶液与氯仿混合，又因氯仿密度大于水且不溶于水，所以氯仿位于下层，蛋白质沉淀位于溶液下部，DNA位于上清液中。本课结束 |
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