科普荧光实验设计前，需要了解的5个步骤了解流式细胞仪激光器和滤片配置在开始设计多色流式细胞术组合前，需要确定：(a) 激光的数量和类型、(b
) 检测器的数量以及 (c) 适用于所用流式细胞仪的滤光片类型。根据这些条件确定要使用的荧光染料类型。荧光染料的激发波长需要与可用
的激光匹配。同时，荧光染料的激发波长还需与可用的滤光片匹配，并且要考虑滤光片可允许通过的波长。预估细胞样本、抗原和荧光染料的搭配某
些细胞群很罕见，或由于功能差异以及受细胞活性水平的影响抗原浓度较低。一般来说，这种情况应使用最亮的荧光染料。例如，PE 通常用于抗
原表达水平低或表达情况不明的靶标，以及/或罕见的细胞群。针对抗原表达水平高的靶标则应使用更暗的荧光染料，例如 PerCP。应该注意
的是，荧光染料的亮度会受到多种因素的影响，例如所用缓冲液以及流式细胞仪类型。避免光谱重叠若需选择光谱重叠较少或没有光谱重叠的荧光染
料，就不能选用最亮的荧光染料。但是，为避免荧光泄露，可以适当牺牲检测器中的亮度。设置好对照物对照物包括未染色的细胞、活/死细胞标记
物、单染阳性对照以及荧光扣除对照 (FMO)，这些对于复杂的多色套装至关重要。调节抗体浓度降低非特异性结合抗体浓度不佳会增加非特异
性结合，或降低测定灵敏度。因此，所有抗体都应进行滴定，以确定最佳的信噪比。 |
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