黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响

DOI: 10.12357/cjea.20220250

孙鹏洲, 罗珠珠, 李玲玲, 牛伊宁, 王晓菲, 田建霞, 刘家鹤. 黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响[J]. 中

国生态农业学报 (中英文), 2023, 31(1): 67?78

SUN P Z, LUO Z Z, LI L L, NIU Y N, WANG X F, TIAN J X, LIU J H. Effects of Medicago sativa cultivation on soil denitrifying

bacterial community in the Loess Plateau[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture, 2023, 31(1): 67?78

黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的

影响

孙鹏洲1, 罗珠珠1,2, 李玲玲2, 牛伊宁2, 王晓菲1, 田建霞1, 刘家鹤1

(1. 甘肃农业大学资源与环境学院　兰州　730070; 2. 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室　兰州　730070)

摘　要: 研究依托布设于黄土高原的长期定位试验, 以紫花苜蓿(Medicago sativa)不同种植年限(2年、9年和

18年)土壤为研究对象, 玉米(Zea mays)地为对照, 基于高通量测序技术和荧光定量PCR技术, 结合冗余分析和分

子生态网络构建, 通过微生物标志(nirK和nirS)对黄绵土区玉米农田和长期种植紫花苜蓿土壤反硝化细菌群落

结构和多样性展开研究。结果表明, 黄绵土区nirK基因丰度明显高于nirS基因丰度, 具有nirK和nirS基因的反硝

化细菌主要隶属于变形菌门(Proteobacteria)。nirK型反硝化细菌已分类优势属为副球菌属(Paracoccus,

1.10%~39.94%)、无色杆菌属(Achromobacter, 0.07%~12.50%)和中华根瘤菌属(Sinorhizobium, 0.50%~7.60%), 且紫

花苜蓿地副球菌属相对丰度显著高于玉米农田(P<0.05), 随紫花苜蓿种植年限延长相对丰度逐渐增加; 无色杆菌属

相对丰度表现为紫花苜蓿地显著低于玉米农田(P<0.05), 丰度随苜蓿种植年限的延长逐渐降低; nirS型反硝化细菌

优势属为罗河杆菌属(Rhodanobacter, 1.42%~5.20%)。相关性分析表明, nirK反硝化基因丰度变化对土壤环境因子

无明显响应, 而nirS反硝化基因丰度与土壤有机碳、全氮和微生物量碳含量呈显著正相关, 与土壤水分和有效磷含

量呈显著负相关。冗余分析结果表明, 土壤水分(P=0.002)和有机碳(P=0.020)是nirK型反硝化细菌群落组成变化

的主导因子, 土壤有效磷(P=0.006)是nirS型反硝化细菌群落结构产生变化的主导因子。分子生态网络分析表明,

黄绵土区nirK型和nirS型反硝化细菌的群落之间均以协同合作关系为主。长期种植苜蓿显著影响土壤中反硝化

细菌的群落组成, 研究结果可为深入探索半干旱区土壤反硝化过程中的微生物机制提供重要科学依据。

关键词: 黄土高原; 紫花苜蓿; nirK基因; nirS基因; 反硝化细菌; 群落结构

中图分类号: S154.3开放科学码(资源服务)标识码(OSID):



Effects of Medicago sativa cultivation on soil denitrifying bacterial community in

the Loess Plateau

SUN Pengzhou1, LUO Zhuzhu1,2, LI Lingling2, NIU Yining2, WANG Xiaofei1, TIAN Jianxia1, LIU Jiahe1

(1. College of Resources and Environmental Sciences, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 2. Gansu Provincial Key

Laboratory of Arid Land Crop Science, Lanzhou 730070, China)





国家自然科学基金项目(31860364, 32160526)、甘肃省优秀研究生“创新之星”项目(2021CXZX-412)和甘肃省中央财政引导地方科技发展专

项(ZCYD-2021-16)资助

通信作者: 罗珠珠, 主要研究方向为土壤生态。E-mail: [e-mail]

孙鹏洲, 主要研究方向为土壤生态。E-mail: [e-mail]

收稿日期: 2022-04-05　接受日期: 2022-06-21

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31860364, 32160526), the Gansu Province Excellent Graduate Innov-

ation Star Project (2021CXZX-412) and the Special Program for Local Science and Technology Development Guided by Central Government of

Gansu Province (ZCYD-2021-16).

Corresponding author, E-mail: [e-mail]

Received Apr. 5, 2022; accepted Jun. 21, 2022



中国生态农业学报 (中英文)　?2023年1月　?第?31?卷　?第?1?期

Chinese?Journal?of?Eco-Agriculture,?Jan.?2023,?31(1):?67?78

http://www.ecoagri.ac.cn

Abstract: Microorganisms with nitrite reductase genes can reduce nitrite to nitric oxide (NO), which is an important influence in the

biological nitrogen cycle. A field study was conducted to investigate soil denitrifying bacteria (nirK- and nirS-type) communities and

diversity in a farmland (Zea mays field) and Medicago sativa land established based on different times (2, 9, and 18 years, respect-

ively expressed as L2019, L2012 and L2003). Illumina MiSeq high-throughput sequencing and real-time fluorescent quantitative PCR tech-

nology were used to investigate the structure and diversity of denitrifying bacterial communities under four treatments (Farmland,

L2003, L2012 and L2019). Redundancy analysis and molecular ecological network analysis were used to evaluate the relationship between

soil physical and chemical properties and denitrifying bacterial community. The results indicated that the abundance of nirK gene was

significantly higher than that of nirS gene. The abundance of nirK gene varied from 4.91×107 to 6.33×107 copies?g?1, whereas the

abundance of nirS gene varied from 1.02×107 to 1.86×107 copies?g?1. The years of M. sativa cultivation did not affect the diversity of

nirK- and nirS-type denitrifying bacteria. Proteobacteria had the highest abundance in the denitrifying bacterial community. The dom-

inant genera of the nirK-type denitrifying bacteria were Paracoccus (1.10%–39.94%), Achromobacter (0.07%–12.50%), and

Sinorhizobium (0.50%–7.60%). The relative abundance of Paracoccus in M. sativa soil was significantly higher than that in maize

soil (P<0.05), and the relative abundance gradually increased with increasing age of M. sativa stands. The relative abundance of

Achromobacter in M. sativa soil was significantly lower than that in maize soil (P<0.05), and the abundance decreased gradually with

increasing age of the M. sativa stand. The dominant genus of nirS-type denitrifying bacteria was Rhodobacter (1.42%–5.20%). There

was no significant difference in Rhodobacter abundance between the maize fields and M. sativa fields. Correlation analysis showed

that the abundance of nirK-type denitrifying bacteria had no significant response to soil environmental factors, but the abundance of

nirS-type denitrifying bacteria had a significant positive correlation with soil organic carbon (r=0.762), total nitrogen (r=0.776), and

microbial biomass carbon (r=0.622) and a significant negative correlation with soil water (r=–0.678) and available phosphorus

(r=–0.628). RDA analysis indicated that soil water (P=0.002) and organic carbon (P=0.020) were the main environmental factors af-

fecting the community structure of nirK-type denitrifying bacteria, and soil available phosphorus (P=0.006) was the main environ-

mental factor affecting the community structure of nirS-type denitrifying bacteria. The proportion of positively correlated edges in the

nirK-type denitrifying bacterial ecological network was 98.37%, and the proportion of negatively correlated edges was 1.63%;

however, all edges in the nirS-type denitrifying bacterial ecological network were positively correlated. This indicated that the rela-

tionship between bacterial communities of both types of denitrifying bacterial was mainly synergistic. In summary, long-term plant-

ing of M. sativa significantly affected the composition of soil denitrifying bacterial community. Our results provide a scientific basis

for further studies on the microbial mechanism of denitrification in the Loess Plateau after years of M. sativa planting.

Keywords: Loess Plateau; Medicago sativa; nirK gene; nirS gene; Denitrifying bacteria; Community structure



反硝化作用作为土壤中氮素损失的重要途径和

温室气体N2O的主要来源[1-2], 主要由4种不同的酶

诱导, 即硝酸盐还原酶(nitrate reductase, Nar)、亚硝

酸盐还原酶(nitrite reductase, Nir)、一氧化氮还原酶

(nitric oxide reductase, Nor)和 氧 化 亚 氮 还 原 酶(ni-

trous oxide reductase, Nos), 其 中 亚 硝 酸 还 原 酶 基 因

(nirK/nirS)被广泛用作反硝化细菌的标记基因[3-4]。

亚硝酸还原酶包含结构不同但功能相同的两种酶,

一种由含细胞色素cd1的nirS基因编码, 另一种由

含铜基的nirK基因编码[5], 这两种酶功能虽相同, 但

催化位点和结构存在差异, 一般不会同时共存于同

一反硝化细菌中, 它们代表着两个生态特性不同的

反硝化细菌类群, 在环境中占据着不同的生态位[6]。

研究认为nirS基因型的反硝化细菌具有更高的丰度,

在环境中占主导地位, 而nirK型反硝化细菌更广泛

存在于微生物群落中[5], 涵盖了更为多样的分类单元。

nirK和nirS两种基因型反硝化细菌群落组成和

多 样 性 与 植 被 类 型 和 土 壤 理 化 性 质 密 切 相 关[7]。

Heylen等 [8]的 研 究 表 明 nirS基 因 在 β-变 形 菌 纲

(Betaproteobacteria)中 较 多, 且 在 科 和 属 水 平 上 与

16S rRNA系统发育关系一致, 而nirK基因普遍存在

于α-变形菌纲(Alphaproteobacteria), 且与16S rRNA

基因系统发育关系不一致。王婷等[9]的研究表明, 土

壤中nirK型反硝化细菌主要与假单胞菌属(Pseudo-

monas)、 产 碱 杆 菌 属 (Alcaligenes)和 根 瘤 菌 属

(Rhizobium)的反硝化细菌具有较近的亲缘关系, 而

nirS型反硝化细菌主要与劳尔氏菌(Ralstonia)和红

长命菌属(Rubrivivax)有较近的亲缘关系。大量研究

表明, nirK反硝化基因型细菌存在于农田[10]、草地[11]

和森林[12]等环境中, 并且发现全氮、硝态氮和pH的

变化会影响nirK型反硝化微生物的群落结构和多样

性[13]。韩晓丽等[14]研究表明, pH、土壤有机碳、土

壤铵态氮和硝态氮等环境因子是影响土壤反硝化细

菌群落结构及组成的关键因子。

紫花苜蓿(Medicago sativa)属多年生豆科牧草,

因其抗旱、耐瘠、优质、高产的特性, 在我国西部

黄土高原地区被广泛种植, 仅甘肃省紫花苜蓿种植

面积达到74.67万hm2, 位居全国第一[15]。长期种植

68 中国生态农业学 报 (中英文 )?2023 第 31 卷

http://www.ecoagri.ac.cn

紫花苜蓿能够增加土壤中碳氮含量[16], 但土壤水分和

有效磷含量被严重消耗[17], 而关于土壤微生物群落的

研究相对较少, 且已有的研究大多局限于细菌[18-19]和

真菌[20], 如 Agnello等[21]对法国地区苜蓿植被恢复潜

力的研究发现, 种植苜蓿能够有效提高根际微生物

活性。Yang等[22]对不同土地利用方式细菌群落的

研究发现, 苜蓿种植能提高细菌群落多样性。马欣

等[23]对黄土高原不同种植年限苜蓿地真菌群落的研

究表明, 不同种植年限苜蓿地土壤真菌群落结构组

成相似性高, 但其优势菌群分布受种植时间的影响。

但是, 有关黄土高原参与土壤氮循环的功能微生物

特别是反硝化微生物的研究几乎未见报道, 而反硝

化作用是旱地土壤氮素损失不可忽视的一个过程,

苜蓿长期种植过程中土壤养分、水分以及温度等多

种因子的变化会影响土壤反硝化作用[24-26], 特别是土

壤中参与氮循环的反硝化微生物的活性受到有效磷

含量的限制[27]。因此, 我们假设, 长期种植紫花苜蓿

会改变土壤中反硝化微生物群落构成和多样性, 且

具有相同功能的nirK和nirS型反硝化细菌对长期种

植紫花苜蓿引起的土壤理化性质变化的响应可能并

不一致。本研究采用荧光定量PCR技术、Illumina

MiSeq高通量测序技术以及分子生态网络的构建, 研

究长期种植紫花苜蓿对西北黄绵土nirK和nirS反硝

化 基 因 丰 度 、 群 落 组 成 的 影 响, 评 估 驱 动nirS和

nirK型反硝化细菌群落结构变化的环境因子, 为深

入探究长期种植紫花苜蓿对土壤反硝化微生物的影

响提供理论依据。

1 材料与方法



1.1 研究区概况

试验区位于甘肃省定西市安定区李家堡镇甘肃

农业大学旱作农业综合试验站(35°28′N, 104°44′E),

该地区属中温带半干旱区, 平均海拔2000 m, 年均日

照时数2476.6 h, 年均太阳辐射592.9 kJ?cm?2, 年均气

温6.4 ℃, ≥0 ℃年均积温2933.5 ℃, ≥10 ℃年均积

温2239.1℃, 无霜期为140 d, 年均降水量390.9 mm,

年蒸发量1531 mm, 是典型的旱作雨养农业区, 土壤

类型为黄绵土。

1.2 试验设计

试 验 以2019年(种 植 年 限 为2年, L2019)、2012

年(种 植 年 限 为9年, L2012)、2003年(种 植 年 限 为

18年, L2003)建植的紫花苜蓿草地为研究对象, 玉米

农田(Farmland)作为对照, 共4个处理, 每个处理设

3次重复, 小区面积3 m×7 m, 间隔0.5 m, 随机区组排

列。苜蓿品种为‘陇东紫花苜蓿’, 建植时施纯氮105

kg?hm?2, 纯P2O5 105 kg?hm?2, 后期均未进行施肥、灌

水。农田采用连作种植模式, 种植作物为当地主栽

作物玉米(Zea mays), 参试品种为‘先玉335’, 种植密

度5.25万株?hm?2, 施纯氮200 kg?hm?2, P2O5 105 kg?hm?2,

所有肥料在播种时作为基肥一次施入, 生育期不再

追肥、灌溉。

1.3 土壤样品采集与处理

于2020年6月下旬(苜蓿第1茬盛花期和玉米

拔节期)采样, 在每个小区内采用五点取样法取耕层

(0~30 cm)土壤, 将样品充分混匀, 去除土壤中的杂

质, 将土样分为两份, 一份装入无菌离心管, 在田间

放入有冰袋的泡沫盒中带回实验室置于?80 ℃冰箱

保存, 用于土壤反硝化微生物DNA提取; 一部分土

样保存于4 ℃冰箱中, 用于测定土壤硝态氮、铵态

氮和微生物量碳氮, 剩余土样待风干后分别过2 mm、

1 mm和0.149 mm筛用于土壤理化性质的测定。

1.4 土壤理化性质的测定

土壤理化性质按照《土壤农化分析》[28]的方法

测定。土壤pH采用电位法(土水比1∶2.5)测定; 土

壤含水率采用烘干法测定; 土壤有机碳采用重铬酸

钾-浓硫酸外加热法测定; 全氮采用H2SO4消煮-凯氏

定氮法测定; 全磷采用H2SO4-HClO4消煮, 钼锑抗比

色法测定; 速效磷采用0.5 mol?L?1 NaHCO3浸提, 钼锑

抗比色法测定; 硝态氮和铵态氮采用2 mol?L?1 KCl溶

液浸提, 半自动化学间断分析仪(Smart Chem AST-

6500S, 意大利)测定; 微生物量碳氮采用氯仿熏蒸-硫

酸钾浸提, 碳氮联合分析仪(Jena multi N/C 2100s, 德

国)测定。

1.5 土壤反硝化微生物高通量测序

土壤微生物DNA提取: 依照Power Soil? DNA

试剂盒提取土壤微生物群落总DNA, 用琼脂糖凝胶

(1%)电泳检测待测DNA的纯度, 用C21H12BrN3染色

后在凝胶成像系统进行检测。

荧光定量PCR: 土壤微生物DNA提取后, 利用

目标基因引物进行PCR扩增, PCR仪为博日Line-

Gene9600plus型荧光定量PCR仪, PCR试剂为ChamQ

SYBR Colorq PCR Master Mix(2X) (南京诺唯赞生物

科技有限公司), 引物和反应条件如表1所示。PCR

扩 增 产 物 用AxyPrepDNA凝 胶 回 收 试 剂 盒(AXY-

GEN公司, 美国)进行纯化后回收。

Illumina Miseq PE300测序: 参考电泳初步定量

结果, 将PCR产物用QuantiFluor?-ST蓝色荧光定量

系统(Promega公司, 北京)进行定量检测, 之后将每

第 1 期 孙鹏洲等 : 黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响 69

http://www.ecoagri.ac.cn

个样本按要求进行混合。利用聚合DNA产物构建

Miseq文库, 然后借助高通量测序平台(Illumina Mis-

eq PE300)测序。以上过程均委托上海美吉生物医药

科技有限公司完成。

1.6 土壤反硝化微生物生态网络构建

选取土壤反硝化细菌OTU间的Spearman相关

系数r>0.6, 显著性P<0.05的物种OTU, 利用R软件

中“igraph”和“psych”包进行微生物群落相关性网络

构建, 应用Gephi 0.9.2软件进行网络可视化分析[29],

并依据“度(Degree) >5”及“中介中心值(betweenness

centrality value) <1000”的准则来选取节点作为关键

物种[30]。

1.7 数据处理

利用上海美吉公司I-sanger云平台(https://cloud.

majorbio.com/)进行反硝化细菌群落结构和多样性分

析, 采用Excel 2019软件对反硝化细菌群落结构进行

数据统计, 利用SPSS 21.0对土壤理化因子和反硝化

微生物群落相对丰度进行单因素方差分析(Anova),

采用多重比较法(Duncan)进行处理间差异显著性分

析, 运用 Canoco 5 软件对反硝化细菌属水平与理化

因子之间进行冗余分析(RDA), 并用Adobe Illustrat-

or CS6软件对图表进行修饰。

2 结果与分析



2.1 苜蓿种植年限对土壤理化性质的影响

不同处理土壤理化性质如表2所示, 紫花苜蓿土

壤水分显著低于玉米农田(P<0.05), 紫花苜蓿种植年

限对土壤水分无明显影响; 土壤有机碳和全氮随紫

花苜蓿种植年限的延长呈增加趋势, 其中L2003处理

土壤有机碳含量显著增加(P<0.05), L2012和L2003处理

土壤全氮含量显著增加(P<0.05); 土壤硝态氮和有效

磷含量紫花苜蓿土壤显著低于农田(P<0.05); 土壤铵

态氮为L2019、L2012紫花苜蓿土壤均显著高于玉米农

田(P<0.05); 土壤微生物量碳和微生物量氮含量紫花

苜蓿土壤均显著高于玉米农田(P<0.05); 土壤pH处

理间无显著差异。



表 2 紫花苜蓿种植年限对土壤理化性质的影响

Table 2 Effects of planting years on soil physical and chemical properties of Medicago sativa

指标 Index Farmland L2019 L2012 L2003

土壤水分 Soil water (%) 20.49±0.12a 15.91±1.02b 14.50±0.28b 14.24±0.21b

有机碳 Organic carbon (g?kg?1) 9.86±0.11b 9.79±0.14b 10.48±0.26b 11.65±0.30a

全氮 Total nitrogen (g?kg?1) 0.98±0.04c 0.96±0.05c 1.13±0.01b 1.28±0.02a

硝态氮 Nitrate nitrogen (mg?kg?1) 17.41±0.19a 11.55±0.46c 11.42±0.14c 13.94±0.71b

铵态氮 Ammonium nitrogen (mg?kg?1) 1.68±0.05b 2.67±0.07a 2.92±0.05a 1.99±0.20b

微生物量碳 Microbial biomass carbon (mg?kg?1) 107.29±11.73c 169.69±5.19b 233.01±2.96a 243.58±19.16a

微生物量氮 Microbial biomass nitrogen (mg?kg?1) 29.26±2.18c 47.51±3.21b 58.16±3.90a 52.42±2.14ab

有效磷 Available phosphorus (mg?kg?1) 13.39±0.43a 7.98±0.18b 7.09±0.05c 6.99±0.09c

pH 8.42±0.06a 8.58±0.07a 8.65±0.06a 8.55±0.07a

　　表内数据为平均值±标准误(n=3), 同行不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05), Farmland和L2019、L2012、L2003分别表示玉米农田和紫花苜蓿

种植2年、9年、18年。Data in table are mean ± standard error (n=3). Different lowercase letters in the same line indicate significant differences among

different treatments (P<0.05). Farmland and L2019, L2012 and L2003 denote maize field and Medicago sativa field planting for 2, 9 and 18 years, respectively.





2.2 苜蓿种植年限对土壤反硝化基因丰度的影响

不同处理反硝化基因拷贝数如图1所示, nirK基

因拷贝数明显高于nirS基因, 其中nirK基因拷贝数

为4.91×107~6.33×107 copies?g?1干土, nirS基因拷贝数

为1.02×107~1.86×107 copies?g?1干土。nirS基因拷贝

数随紫花苜蓿种植年限的延长呈增加趋势, L2003显著

高于L2019和玉米农田(P<0.05), 但nirK基因拷贝数

处理间无明显差异。

反硝化基因拷贝数与土壤理化因子相关性分析

表明(表3), nirK反硝化基因拷贝数变化对土壤理化

因子无明显响应, 而nirS反硝化基因拷贝数与土壤

有机碳、全氮、微生物量碳呈显著(P<0.05)或极显

表 1 反硝化基因的引物序列及PCR反应条件

Table 1 Primer sequences of denitrifying genes and PCR reaction conditions

目标基因

Target gene

引物名称

Prime name

引物序列 (5′－ 3′)

Sequence (5′－ 3′)

PCR反应条件

PCR condition

nirK nirK1aCuF

nirKR3CuR

ATCATGGTSCTGCCGCG

GCCTCGATCAGRTTGTGGTT

95 ℃ 预变性 3 min, 95 ℃ 变性 30 s, 56 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 40 s,

循环 35次

95 ℃ for 3 min × 1 cycle, 95 ℃ for 30 s， 56 ℃ for 30 s， 72 ℃ for

40 s × 35 cycles

nirS cd3aF

R3cdR

GTSAACGTSAAGGARACSGG

GASTTCGGRTGSGTCTTGA

70 中国生态农业学 报 (中英文 )?2023 第 31 卷

http://www.ecoagri.ac.cn

著(P<0.01)正相关关系, 与土壤水分、有效磷呈显

著负相关关系(P<0.05)。

2.3 苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌群落多样性的

影响

α多样性指数(表4)表明, 苜蓿种植年限对反硝

化细菌群落多样性和丰富度无显著影响。进一步基

于Bray_Curtis算法计算样本间距离矩阵进行PCoA

分 析(图2), 结 果 表 明, nirK型 反 硝 化 细 菌(图2A)

PC1值 和 PC2值 分 别 为 53.50%和 18.23%, L2012、

L2003主要分布于第1、4象限, L2019主要分布于第1、

2象限, 而农田土壤主要分布于第3象限; nirS型反

硝化细菌(图2B) PC1值为37.54%, PC2值为13.33%,

L2019、L2012和L2003主要分布于第1、4象限, 而农田

在PCoA1轴上的坐标为负值, 与其余4个处理明显

分开。采用基于距离矩阵的PERMANOVA分析发

现, 两类反硝化细菌群落在不同处理间均存在显著

差异(P<0.05)。



表 3 土壤反硝化基因拷贝数与土壤理化因子相关分析

Table 3 Correlation analysis of soil denitrifying gene abundance and soil physicochemical properties

反硝化基因

Denitrifying

genes

水分

Soil

moisture

有机碳

Organic

carbon

全氮

Total

nitrogen

硝态氮

Nitrate

nitrogen

铵态氮

Ammonium

nitrogen

微生物量碳

Microbial

carbon

微生物量氮

Microbial

nitrogen

有效磷

Available

phosphorus

pH

nirK ?0.252 0.510 0.406 ?0.091 ?0.245 0.161 0.280 ?0.353 ?0.203

nirS ?0.678 0.762 0.776 0.217 ?0.112 0.622 0.517 ?0.628 ?0.119

　　: P<0.01; : P<0.05.





表 4 紫花苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌α多样性的影响

Table 4 Effects of Medicago sativa planting years on soil denitrifying bacteria alpha diversity

反硝化细菌

Denitrifying bacteria

处理

Treatment

Sobs指数

Sobs index

Chao1指数

Chao1 index

Shannon指数

Shannon index

Simpson指数

Simpson index

nirK型

nirK-type

Farmland 203.67±26.54a 234.66±33.70a 3.08±0.19a 0.11±0.01a

L2019 198.67±30.32a 220.19±33.70a 3.36±0.19a 0.09±0.02a

L2012 241.33±9.56a 280.83±13.84a 3.40±0.08a 0.07±0.01a

L2003 232.00±28.57a 269.56±35.59a 3.17±0.29a 0.13±0.06a

nirS型

nirS-type

Farmland 600.00±53.86a 776.01±77.39a 4.75±0.08a 0.02±0.00a

L2019 568.67±42.25a 803.88±37.30a 4.60±0.03a 0.02±0.00a

L2012 786.33±117.78a 1050.13±150.43a 4.99±0.20a 0.02±0.00a

L2003 556.00±52.94a 751.36±70.42a 4.70±0.11a 0.02±0.00a

　　表内数据为平均值±标准误(n=3), 同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。Farmland和L2019、L2012、L2003分别表示玉米农田和紫花苜蓿种

植2年、9年、18年。Data in table are mean ± standard error (n=3). Different lowercase letters in the same column indicate significant differences among

different treatments (P<0.05). Farmland and L2019, L2012 and L2003 denote maize field and Medicago sativa field planting for 2, 9 and 18 years, respectively.





2.4 苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌群落结构的

影响

土壤nirK和nirS两类反硝化菌群中含有大量分

类地位不明确的微生物, 丰度分别为31.78%~63.02%、

33.81%~51.79%; 已明确注释的微生物中, 均以变形

菌 门(Proteobacteria)为 主(表5), 相 对 丰 度 分 别 为

36.98%~68.22%和48.21%~66.19%。 紫 花 苜 蓿 种 植

年限对nirK型反硝化细菌变形菌门丰度未产生明显

影响, 但显著提高了nirS型反硝化细菌变形菌门丰

度(P<0.05)。

属水平下, nirK型反硝化细菌已注释属为13种,

优势属主要有副球菌属(Paracoccus, 1.10%~39.94%)、



nirK nirS

a a a

a

a

8

7

6

5

4

3

2

1

0

cbc ab

Farmland

基因拷贝数

Gene copies

( 10

7 copies?g

?1

)

L2019 L2012 L2003

处理 Treatment

图 1 紫花苜蓿种植年限对土壤反硝化基因nirK和nirS

拷贝数的影响

Fig. 1 Effects of Medicago sativa planting years on copies of

soil denitrifying genes of nirK and nirS

图中误差棒表示标准误(n=3), 不同小写字母表示处理间差异显

著(P<0.05)。Farmland和L2019、L2012、L2003分别表示玉米农田和紫花

苜蓿种植2年、9年、18年。In the figure, the error bar represents standard

error (n=3). Different lowercase letters indicate significant differences

among different treatments (P<0.05). Farmland and L2019, L2012 and L2003 de-

note maize field and Medicago sativa field planting for 2, 9 and 18 years, re-

spectively.

第 1 期 孙鹏洲等 : 黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响 71

http://www.ecoagri.ac.cn

无色杆菌属(Achromobacter, 0.07%~12.50%)、中华根

瘤菌属(Sinorhizobium, 0.50%~7.60%)。副球菌属相

对丰度紫花苜蓿土壤显著高于玉米农田(P<0.05), 且

其丰度随着紫花苜蓿种植年限延长逐渐增加; 无色

杆菌属丰度玉米农田显著高于紫花苜蓿土壤(P<0.05),

且随着紫花苜蓿种植年限延长逐渐降低; 中华根瘤

菌属相对丰度随着种植年限的延长其丰度逐渐降低,

且玉米农田中相对丰度高于紫花苜蓿土壤, 但处理

间无明显差异。同时, 本研究还发现, 中慢生根瘤菌

属(Mesorhizobium)、 亚 硝 化 螺 菌 属(Nitrosospira)、

柠檬酸杆菌属(Citrobacter)仅在紫花苜蓿土壤中检

测 到, 而Ensifer、Starkeya、 产 碱 菌 属(Alcaligenes)

仅在玉米农田中检测到。

已注释的nirS型反硝化细菌共有7属, 优势属

为罗河杆菌属(Rhodanobacter, 1.42%~5.20%), 同时检

测到部分相对丰度较低的属, 如固氮螺菌属 (Azospir-

illum, 0.58%~0.73%)、 假 单 胞 菌 属 (Pseudomonas,

0.01%~0.67%)、 Azospira (0.03%~0.32%)。 Azospira

相对丰度玉米农田显著高于紫花苜蓿土壤(P<0.05),

其余属处理间均无显著差异。另外, 紫花苜蓿土壤

中检测到了博德特氏菌属(Bordetella)和磁螺菌属

(Magnetospirillum)等稀有物种, 玉米农田检测到了草

螺菌属(Herbaspirillum)。

为进一步揭示影响土壤反硝化细菌群落结构的

主要环境因子, 以土壤反硝化细菌属水平群落丰度

为响应变量, 土壤理化因子为解释变量进行冗余分

析。结果表明, nirK型反硝化细菌群落(图3A)在两

个排序轴上的解释度为77.35%和9.16%, Monte Carlo

检验表明, 土壤水分(P=0.002)和有机碳(P=0.02)对

nirK型反硝化细菌群落结构产生显著影响; nirS型反

硝化细菌群落(图3B)在两排序轴上的解释度分别

为46.00%和32.40%, 土 壤 有 效 磷(P=0.006)对nirS

型反硝化细菌群落构成产生显著影响。

2.5 土壤反硝化细菌群落生态网络分析

基于OTU水平构建反硝化细菌分子生态网络,

其 中nirK型 反 硝 化 细 菌 生 态 网 络(图4A)共 得 到

101个节点, 429条边, 正相关的边所占比例为98.37%,

负相关的边所占比例为1.63%, 平均度为7.27, 平均

加权度为10.03, 网络直径为9.00, 图密度为0.061, 平

均聚类系数为0.496, 模块化系数0.55, 表明具有模块

结构。nirK型反硝化微生物生态网络共得到4个模

块, 基于节点度大于5和中介中心值小于1000的标

准, 得到66个关键物种OTU, 主要分布在Module 1

和Module 2, Module 3和Module 4中分布较少, 关键

物种OTU主要隶属于副球菌属、无色杆菌属、中

华根瘤菌属、Bosea以及未明确注释(unclassified)的

反硝化细菌。nirS型反硝化细菌生态网络(图4B)共

得到274个节点, 1793条边, 所有的边均为正相关,

网络平均度为12.27, 平均加权度为17.64, 网络直径

为9, 图密度为0.04, 平均聚类系数为0.35, 模块化系

数为0.48, 表明具有模块结构。nirS型反硝化细菌生

态网络共得到5个模块, 基于节点度大于5和中介中

心值小于1000的标准, 得到219个关键物种OTU,

主要分布在Module 1、Module 2和Module 3, Mod-

ule 4和Module 5分布相对较少, 且关键物种OTU主

要为未明确分类(unclassified)的反硝化细菌。



PC1 (53.50%)

A

0.4

0.3

0.2

0.1

0

?0.1

?0.2

?0.4 ?0.2 0 0.2 0.4

BR2=0.5532, P=0.001 R2=0.5065, P=0.001

PC2 (18.23%)

PC1 (37.54%)

0.2

0.1

0

?0.1

?0.2

?0.4 ?0.3 ?0.2 ?0.1 0 0.1 0.2

PC2 (13.33%)

Farmland

L2019

L2012

L2003



图 2 不同种植年限紫花苜蓿土壤反硝化细菌PCoA分析

Fig. 2 PCoA analysis of soil denitrifying bacteria with different planting years of Medicago sativa

图中Farmland和L2019、L2012、L2003分别表示玉米农田和紫花苜蓿种植2年、9年、18年。图A为 nirK 型反硝化细菌, 图B为 nirS 型反硝化

细菌。In the figure, Farmland and L2019, L2012 and L2003 denote maize field and Medicago sativa field planting for 2, 9 and 18 years, respectively. Figure A is

nirK-type denitrifying bacteria and figure B is nirS-type denitrifying bacteria.

72 中国生态农业学 报 (中英文 )?2023 第 31 卷

http://www.ecoagri.ac.cn

表 5 紫花苜蓿种植年限对土壤反硝化细菌群落相对丰度的影响

Table 5 Effects of Medicago sativa planting years on the relative abundances of soil denitrifying bacterial communities

反硝化细菌

Denitrifying bacteria

分类

Taxa

相对丰度 Relative abundance (%) P-value

Farmland L2019 L2012 L2003

nirK 门 Phylum 变形菌门 Proteobacteria 36.98a 46.80a 68.22a 60.95a 0.077

纲 Class α-变形菌纲 Alphaproteobacteria 22.62b 40.87ab 63.98a 57.63a 0.017

β-变形菌纲 Betaproteobacteria 12.51a 3.36b 0.51b 0.17b 0.021

γ-变形菌纲 Gammaproteobacteria 0.00a 0.00a 0.02a 0.00a 0.441

目 Order 根瘤菌目 Rhizobiales 19.00a 18.76a 27.05a 15.78a 0.200

红细菌目 Rhodobacterales 1.10b 18.18ab 34.31a 39.94a 0.012

伯克氏菌目 Burkholderiales 12.51a 3.34b 0.50b 0.07b 0.021

亚硝化单胞菌目 Nitrosomonadales 0.00a 0.02a 0.01a 0.11a 0.464

肠杆菌目 Enterobacteriales 0.00a 0.00a 0.02a 0.00a 0.441

科 Family 红杆菌科 Rhodobacteraceae 1.10b 18.18ab 34.31a 39.94a 0.012

根瘤菌科 Rhizobiaceae 10.82a 7.25a 15.28a 8.44a 0.399

产碱菌科 Alcaligenaceae 12.51a 3.34b 0.50b 0.07b 0.021

慢生根瘤菌科 Bradyrhizobiaceae 1.61b 1.94b 5.76ab 4.43a 0.032

叶杆菌科 Phyllobacteriaceae 0.02a 0.02a 1.41a 0.03a 0.406

亚硝化单胞菌科 Nitrosomonadaceae 0.00a 0.02a 0.01a 0.11a 0.464

布鲁氏菌科 Brucellaceae 0.06a 0.01a 0.05a 0.00a 0.652

黄色杆菌科 Xanthobacteraceae 0.03a 0.00a 0.00a 0.00a 0.479

肠杆菌科 Enterobacteriaceae 0.00a 0.00a 0.02a 0.00a 0.441

属 Genus 副球菌属 Paracoccus 1.10a 18.18ab 34.31b 39.94b 0.012

无色杆菌属 Achromobacter 12.50a 3.32b 0.50b 0.07b 0.021

中华根瘤菌属 Sinorhizobium 7.60a 4.24a 2.66a 0.50a 0.312

Bosea 0.93a 1.02a 2.55a 1.38a 0.111

Afipia 0.08a 0.03a 0.07a 0.20a 0.432

中慢生根瘤菌属 Mesorhizobium 0.00a 0.02a 1.40a 0.03a 0.417

慢生根瘤菌属 Bradyrhizobium 0.08a 0.04a 0.01a 0.07a 0.555

Ensifer 0.10a 0.00a 0.00a 0.00a 0.441

苍白杆菌属 Ochrobactrum 0.06a 0.01a 0.05a 0.00a 0.652

亚硝化螺菌属 Nitrosospira 0.00a 0.02a 0.00a 0.11a 0.433

Starkeya 0.03a 0.00a 0.00a 0.00a 0.479

柠檬酸杆菌属 Citrobacter 0.00a 0.00a 0.02a 0.00a 0.441

产碱菌属 Alcaligenes 0.01a 0.00a 0.00a 0.00a 0.441

nirS 门 Phylum 变形菌门 Proteobacteria 48.21b 65.70a 66.19a 61.49a 0.009

纲 Class γ-变形菌纲 Gammaproteobacteria 5.26a 2.09a 3.17a 2.22a 0.161

β-变形菌纲 Betaproteobacteria 2.15a 2.87a 2.54a 2.00a 0.642

α-变形菌纲 Alphaproteobacteria 1.50a 2.13a 2.87a 3.19a 0.213

目 Order 黄单胞菌目 Xanthomonadales 5.20a 1.42a 2.93a 2.21a 0.141

红螺菌目 Rhodospirillales 0.67a 0.85a 0.91a 0.95a 0.804

假单胞菌目 Pseudomonadales 0.07a 0.67a 0.25a 0.01a 0.530

红环菌目 Rhodocyclales 0.33a 0.03b 0.00b 0.01b 0.034

伯克氏菌目 Burkholderiales 0.20a 0.00a 0.00a 0.08a 0.181

科 Family 黄单胞菌科 Xanthomonadaceae 5.20a 1.42a 2.93a 2.21a 0.141

红螺菌科 Rhodospirillaceae 0.67a 0.85a 0.91a 0.95a 0.804

假单胞菌科 Pseudomonadaceae 0.07a 0.67a 0.25a 0.01a 0.530

红环菌科 Rhodocyclaceae 0.33a 0.03b 0.00b 0.01b 0.034

产碱菌科 Alcaligenaceae 0.00a 0.00a 0.00a 0.08a 0.441

草酸杆菌科 Oxalobacteraceae 0.01a 0.00a 0.00a 0.00a 0.441

属 Genus 罗河杆菌属 Rhodanobacter 5.20a 1.42a 2.93a 2.21a 0.141

固氮螺菌属 Azospirillum 0.58a 0.70a 0.70a 0.73a 0.935

假单胞菌属 Pseudomonas 0.07a 0.67a 0.25a 0.01a 0.530

Azospira 0.32a 0.03b 0.00b 0.00b 0.039

博德特氏菌属 Bordetella 0.00a 0.00a 0.00a 0.08a 0.441

草螺菌属 Herbaspirillum 0.01a 0.00a 0.00a 0.00a 0.441

磁螺菌属 Magnetospirillum 0.00a 0.01a 0.00a 0.00a 0.441

　　表内数据为平均值(n=3), 同行不同小写字母表示不同处理间差异显著(P<0.05), Farmland和L2019、L2012、L2003分别表示玉米农田和紫花苜蓿种植2年、

9年、18年。Data in table are mean (n=3). Different lowercase letters in the same line indicate significant differences among different treatments (P<0.05).

Farmland and L2019, L2012 and L2003 denote maize field and Medicago sativa field planting for 2, 9 and 18 years, respectively.

第 1 期 孙鹏洲等 : 黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响 73

http://www.ecoagri.ac.cn

3 讨论

长期种植紫花苜蓿显著增加土壤碳、氮养分的

同时也造成土壤水分和磷素的亏缺, 种植年限引起

土壤理化因子的改变最后造成反硝化基因与关联群

落差异。此前已有研究发现稻田土壤中反硝化功能

基因nirK的拷贝数高于nirS基因拷贝数[31], 也有研



NH4+-N

NO3?-N

1

?1

pH

MBC

MBN

B

TN

SOC

AP

A

SW

RDA1 (77.35%)

RDA2 (9.16%)

NH4+-N

NO3?-N

1

?1

pH

MBC

MBN

TN SOC

AP

SW

RDA1 (46.00%)

RDA2 (32.40%)

Farmland

L2019

L2012

L2003

?1 1 ?1 1

图 3 不同种植年限紫花苜蓿土壤反硝化细菌与土壤理化因子RDA分析

Fig. 3 Redundancy analysis of soil denitrifying bacteria community structure and physicochemical properties in different treatments

of Medicago sativa planting years

图中SW、SOC、TN、NO3?-N、NH4+-N、MBC、MBN和AP分别表示土壤水分、有机碳、全氮、硝态氮、铵态氮、微生物量碳、微生物量

氮和有效磷, Farmland和L2019、L2012、L2003分别表示玉米农田和紫花苜蓿种植2年、9年、18年。图A和图B分别表示nirK型和nirS型反硝化

细菌属水平群落组成与土壤理化因子冗余分析。In the figure, SW, SOC, TN, NO3?-N, NH4+-N, MBC, MBN and AP are soil water, organic carbon, total

nitrogen, nitrate nitrogen, ammonium nitrogen, microbial biomass carbon, microbial biomass nitrogen and available phosphorus, respectively. Farmland and

L2019, L2012 and L2003 denote maize field and Medicago sativa field planting for 2, 9 and 18 years, respectively. Figures A and B represent the redundancy analysis

of nirK- and nirS-type denitrifying bacterial community composition with respect to soil physicochemical factors, respectively.



A B

Module 1

(32.67%)

Module 2

(32.67%)

Module 3

(20.79%)

Module 4

(13.86%)

Module 1

(26.28%)

Module 2

(21.90%)

Module 3

(21.17%)

Module 4

(18.61%)

Module 5

(12.04%)

图 4 土壤反硝化细菌群落网络分析

Fig. 4 Network analysis of soil denitrifying bacteria community

图中节点大小与连接的数量(度)呈正比。节点与节点间边的颜色显示了物种间的作用关系, 绿色代表正相关, 即物种间存在协同合作关系;

橙色代表负相关, 表示物种间存在竞争关系。图A和B分别表示nirK型和nirS型反硝化细菌分子生态网络。Module 1、Module 2、Module 3、

Module 4、Module 5表示微生物网络模块。In the figure, the size of nodes is positively proportional to the number (degree) of connections. The colors of

nodes and edges between nodes show the interaction between species. Green represents positive correlation, there is a cooperative relationship between species.

Orange represents negative correlation, there is a competitive relationship between species. Fig. A and B respectively represent nirK- and nirS-type denitrifying

bacterial ecological networks. Module 1, Module 2, Module 3, Module 4, and Module 5 indicate microbial network modules.

74 中国生态农业学 报 (中英文 )?2023 第 31 卷

http://www.ecoagri.ac.cn

究发现旱地土壤反硝化功能基因nirS拷贝数高于

nirK的拷贝数[4,32]。本试验条件下, 紫花苜蓿地和玉

米农田中nirK反硝化基因拷贝数均明显高于nirS反

硝化基因拷贝数, 说明具有nirK基因的微生物是黄

绵土区主要的反硝化微生物。nirS基因拷贝数随紫

花苜蓿种植年限的延长显著增加(P<0.05), 而nirK

基因无显著变化, 说明nirK和nirS型反硝化细菌在

土壤中可能占据着不同的生态位[33]。研究同时发现,

nirK基因拷贝数在紫花苜蓿地与农田之间无显著差

异, 而nirS基因拷贝数表现为L2003处理显著高于玉

米农田(P<0.05), 原因可能是nirS型反硝化细菌对长

期种植紫花苜蓿过程中土壤碳氮积累的响应较为迅

速, 进而导致nirS微生物体现出差异[34], 而nirK型反

硝化细菌则受到土壤环境因子、作物类型和根系分

泌物的联合调控[35-36]。

反硝化微生物广泛存在于细菌和古菌中, 部分

真菌线粒体中也发现反硝化作用[37]。本研究发现黄

绵土中参与反硝化作用的微生物主要为细菌, 也有

部 分 古 菌, 同 时 还 存 在 许 多 未 明 确 分 类 的nirK和

nirS基因序列, 其中是否存在具有反硝化作用的真

菌, 还需要进一步的探究。本研究所检测到的反硝

化细菌中未明确分类的相对丰度较高, 但已分类的

反硝化细菌主要以变形菌门(Proteobacteria)为主, 与

前人[37]的研究结果一致, 可能是由于变形菌中包含

了各种营养类型的细菌, 且其在土壤中的分布较为

广泛[38]。土壤理化性质在一定程度上决定着土壤微

生物结构。在属分类水平上, 副球菌属作为各土壤

样本中所共有的、分布较为广泛的nirK型反硝化细

菌优势属, 表现出对紫花苜蓿地生境的偏好(18.18%~

39.94%)和对玉米农田生境的偏离(1.10%), 无色杆

菌属和中华根瘤菌属趋势刚好相反, 表现出对玉米

农田生境的偏好和对紫花苜蓿地生境的偏离。已有

研究表明土壤nirK型反硝化细菌群落结构的差异主

要是多种因子综合影响的, 例如土壤水分[39]、全氮[40]、

有 机 碳[41]等, Bremer等[42]发 现 植 被 类 型 的 改 变 对

nirK反硝化微生物群落结构也具有显著的影响。因

此, 紫花苜蓿通过固氮作用和凋落物的分解增加土

壤中可利用的碳源和氮源的同时, 使得土壤nirK型

反硝化细菌群落结构发生显著变化。其次, 本研究

中, nirK型反硝化细菌群落构成受水分的显著影响,

与刘若萱等[43]的研究结果一致。与稻田土壤和热带

森林土壤中nirS型反硝化细菌主要来自于嗜盐单胞

菌属(Halomonas)和贪铜菌属(Cupriavidus)不同[44-45],

黄绵土nirS型反硝化细菌优势属为罗河杆菌属, 这

可能与土壤类型有关, 因为部分细菌存在环境特异

性[46]。固氮螺菌属和假单胞菌属是少量存在于各土

壤样本中的nirS型反硝化细菌, 固氮螺菌属可以促

进反硝化作用, 其相对丰度和氮素水平密切相关能

够加快脱氮过程[47], 假单胞菌属具有代谢多样性, 广

泛存在于各种环境中[7]。另外, 本研究还发现长期种

植紫花苜蓿使部分反硝化微生物凋亡, 如存在于玉

米农田土壤的产碱菌属和草螺菌属并未在紫花苜蓿

土壤中检测到。同时, 长期种植紫花苜蓿后也促生

了一些特有菌群, 例如仅存在于紫花苜蓿土壤中的

中慢生根瘤菌属和柠檬酸杆菌属。湛钰等[44]对磷差

异调控水稻(Oryza sativa)土壤反硝化微生物群落结

构影响的研究表明, 含nirS基因的微生物群落对土

壤磷含量的变化较为敏感, 结合本研究冗余分析结

果, 推测可能是因为紫花苜蓿地和玉米地磷含量的

差异导致nirS基因微生物群落结构发生变化。周婷

婷等[7]发现, 土壤全氮含量也会影响土壤nirS型反

硝化细菌生长, 其次作物根系分泌物能诱导和刺激

特殊种群的细菌在根际定殖, 某些微生物类群对特

定环境因子的嗜好, 导致出现了生态位分化现象[48]。

因此, 土壤中反硝化细菌群落结构的变化并非单一

因子驱动, 黄土高原半干旱区土壤反硝化细菌群落

组成的变化是多种因子共同驱动的。

自然环境下的任何物种都与其他物种形成复杂

的生态网络结构, 生态网络的结构特性不仅可以揭

示物种之间的复杂关系, 还可以表征生态网络结构

的稳定性[49]。本研究构建了两类反硝化微生物生态

网络, 发现nirK型反硝化细菌的生态网络具有更高

的平均聚类系数, 而nirS型反硝化细菌拥有更多的

连线和节点数目, 这表明nirK型反硝化微生物的网

络结构更为简化, 且网络中节点之间的联系更加紧

密, 而紧密联系在一起的网络所具有的较低模块性

也使其更易受环境波动的影响[50], 这可能对维持土壤

微生物生态系统的健康性和稳定性造成不利影响。

此外, 本研究所涉及的nirS型反硝化细菌的生态网

络节点之间均是正相关, 而nirK型反硝化细菌的生

态网络节点之间具有一定的负相关, 说明nirK型反

硝化微生物之间存在一定程度的养分竞争关系, 而

nirS型反硝化微生物之间存在更为普遍的协同合作

效应。

4 结论

长期种植紫花苜蓿显著增加土壤碳、氮养分的

同时也造成土壤水分和磷素的亏缺, 种植年限引起

第 1 期 孙鹏洲等 : 黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响 75

http://www.ecoagri.ac.cn

土壤因子的改变最后造成反硝化基因与关联群落差

异。尽管nirK基因拷贝数明显高于nirS基因拷贝

数, 但紫花苜蓿种植显著提高了nirS基因拷贝数, 而

对nirK基因并无明显影响。本研究土壤反硝化细菌

大多隶属于变形菌, 其中nirK型反硝化细菌优势属

为副球菌属、无色杆菌属和中华根瘤菌属, nirS型反

硝化细菌优势属为罗河杆菌属。土壤水分和有机碳

是驱动nirK型反硝化细菌群落结构发生变化的主导

因子, 而土壤磷素是驱动黄绵土nirS型反硝化细菌

群落结构变化的最主要因素。微生物生态网络分析

表明nirK和nirS型反硝化细菌群落间均具有较强的

协同合作关系。

参考文献 References

赵光昕, 张晴雯, 刘杏认, 等. 农田土壤硝化反硝化作用及

其对生物炭添加响应的研究进展[J]. 中国农业气象, 2018,

39(7): 442?452

ZHAO G X, ZHANG Q W, LIU X R, et al. Nitrification and

denitrification and its response to biochar addition in

agricultural soil: a review[J]. Chinese Journal of

Agrometeorology, 2018, 39(7): 442?452

[1]

YIN C, FAN F L, SONG A L, et al. Denitrification potential

under different fertilization regimes is closely coupled with

changes in the denitrifying community in a black soil[J].

Applied Microbiology and Biotechnology, 2015, 99(13):

5719?5729

[2]

曹林桦, 刘彩霞, 刘茗, 等. 集约经营对毛竹林土壤反硝化

细菌丰度的影响[J]. 土壤学报, 2020, 57(3): 710?720

CAO L H, LIU C X, LIU M, et al. Effects of intensive

management practice on functional gene abundance of

denitrifying bacteria in the soil of moso bamboo (Phyllostachys

heterocycla) plantation[J]. Acta Pedologica Sinica, 2020, 57(3):

710?720

[3]

ZHOU S L, HUANG T L, ZHANG C H, et al. Illumina MiSeq

sequencing reveals the community composition of NirS-Type

and NirK-Type denitrifiers in Zhoucun Reservoir — A large

shallow eutrophic reservoir in Northern China[J]. RSC

Advances, 2016, 6(94): 91517?91528

[4]

ZUMFT W G. Cell biology and molecular basis of

denitrification[J]. Microbiology and Molecular Biology

Reviews: MMBR, 1997, 61(4): 533?616

[5]

JONES C M, HALLIN S. Ecological and evolutionary factors

underlying global and local assembly of denitrifier

communities[J]. The ISME Journal, 2010, 4(5): 633?641

[6]

周婷婷, 胡文革, 钟镇涛, 等. 不同季节艾比湖湿地盐角草根

际nirS-型与nirK-型反硝化细菌群落组成分析[J]. 生态学报,

2022, 42(13): 5314–5327

ZHOU T T, HU W G, ZHONG Z T, et al. Community

composition of nirS-type and nirK-type denitrifying bacteria in

rhizosphere of Salicornia europaea in the Ebinur Lake Wetland

during different seasons[J/OL]. Acta Ecologica Sinica, 2022,

42(13): 5314–5327

[7]

HEYLEN K, GEVERS D, VANPARYS B, et al. The incidence

of nirS and nirK and their genetic heterogeneity in cultivated

denitrifiers[J]. Environmental Microbiology, 2006, 8(11):

2012?2021

[8]

王婷, 刘丽丽, 张克强, 等. 牛场肥水灌溉对土壤nirK、

nirS型反硝化微生物群落结构的影响[J]. 生态学报, 2017,

37(11): 3655?3664

WANG T, LIU L L, ZHANG K Q, et al. Effects of cattle

fertilizer on community structure of nirK- and nirS-type

denitrifying bacteria in soil[J]. Acta Ecologica Sinica, 2017,

37(11): 3655?3664

[9]

朱杰, 刘海, 吴邦魁, 等. 稻虾共作对稻田土壤nirK反硝化

微生物群落结构和多样性的影响[J]. 中国生态农业学报,

2018, 26(9): 1324?1332

ZHU J, LIU H, WU B K, et al. Effects of integrated rice-

crayfish farming system on community structure and diversity

of nirK denitrification microbe in paddy soils[J]. Chinese

Journal of Eco-Agriculture, 2018, 26(9): 1324?1332

[10]

KEIL D, MEYER A, BERNER D, et al. Influence of land-use

intensity on the spatial distribution of N-cycling microorganisms

in grassland soils[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2011, 77(1):

95?106

[11]

CHEN J, NIE Y X, LIU W, et al. Ammonia-oxidizing Archaea

are more resistant than denitrifiers to seasonal precipitation

changes in an acidic subtropical forest soil[J]. Frontiers in

Microbiology, 2017, 8: 1384

[12]

HAN B, YE X H, LI W, et al. The effects of different irrigation

regimes on nitrous oxide emissions and influencing factors in

greenhouse tomato fields[J]. Journal of Soils and Sediments,

2017, 17(10): 2457?2468

[13]

韩晓丽, 黄春国, 张芸香, 等. 文峪河上游河岸带不同植被

类型土壤nirS反硝化菌群结构及功能[J]. 生态学报, 2020,

40(6): 1977?1989

HAN X L, HUANG C G, ZHANG Y X, et al. nirS-type

denitrifiers community composition and function in different

riparian vegetation types in upper Wenyuhe watershed[J]. Acta

Ecologica Sinica, 2020, 40(6): 1977?1989

[14]

江影舟, 南志标, 王丽佳. 基于钻石模型理论的甘肃省苜蓿

产业竞争力分析[J]. 草业科学, 2016, 33(4): 813?820

JIANG Y Z, NAN Z B, WANG L J. Competitiveness of alfalfa

industry in Gansu Province — A diamond model[J].

Pratacultural Science, 2016, 33(4): 813?820

[15]

孙鹏洲, 罗珠珠, 李玲玲, 等. 黄土高原干旱区长期种植紫

花苜蓿和一年生作物轮作对土壤真菌群落的影响[J]. 中国生

态农业学报(中英文), 2022, 30(6): 965?975

SUN P Z, LUO Z Z, LI L L, et al. Influences of continuous

monoculture of alfalfa and rotation of annual crops on soil

fungal communities in the semi-arid Loess Plateau[J]. Chinese

Journal of Eco-Agriculture, 2022, 30(6): 965?975

[16]

CHEN Z, LUO X Q, HU R G, et al. Impact of long-term

fertilization on the composition of denitrifier communities based

on nitrite reductase analyses in a paddy soil[J]. Microbial

Ecology, 2010, 60(4): 850?861

[17]

马欣, 罗珠珠, 张耀全, 等. 黄土高原雨养区不同种植年限

紫花苜蓿土壤细菌群落特征与生态功能预测[J]. 草业学报,

[18]

76 中国生态农业学 报 (中英文 )?2023 第 31 卷

http://www.ecoagri.ac.cn

2021, 30(3): 54?67

MA X, LUO Z Z, ZHANG Y Q, et al. Distribution

characteristics and ecological function predictions of soil

bacterial communities in rainfed alfalfa fields on the Loess

Plateau[J]. Acta Prataculturae Sinica, 2021, 30(3): 54?67

翟亚萍, 王绍明, 刘鸯, 等. 不同种植地苜蓿根际土壤细菌

群落结构多样性差异分析[J]. 新疆农业科学, 2021, 58(5):

955?964

ZHAI Y P, WANG S M, LIU Y, et al. Study on structural

diversity of bacterial community in rhizosphere soil of alfalfa in

parts of northern foot of Tianshan Mountains[J]. Xinjiang

Agricultural Sciences, 2021, 58(5): 955?964

[19]

牟红霞, 张文文, 刘秉儒. 引黄灌区不同种植年限紫花苜蓿

土壤真菌群落多样性特征[J]. 水土保持研究, 2021, 28(4):

91?96+104

MOU H X, ZHANG W W, LIU B R. Soil fungi community

diversity in Medicago sativa field of different planting years at

Yellow River diversion irrigation area[J]. Research of Soil and

Water Conservation, 2021, 28(4): 91?96+104

[20]

AGNELLO A C, HUGUENOT D, VAN HULLEBUSCH E D,

et al. Citric acid- and Tween 80-assisted phytoremediation of a

co-contaminated soil: Alfalfa (Medicago sativa L.) performance

and remediation potential[J]. Environmental Science and

Pollution Research, 2016, 23(9): 9215?9226

[21]

YANG Y, DOU Y X, HUANG Y M, et al. Links between soil,

fungal diversity and plant and soil properties on the Loess

Plateau[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 2198?2210

[22]

马欣, 罗珠珠, 张耀全, 等. 黄土高原雨养区不同种植年限

紫花苜蓿土壤真菌群落的分布特征[J]. 干旱地区农业研究,

2021, 39(3): 162?170

MA X, LUO Z Z, ZHANG Y Q, et al. Distribution

characteristics of soil fungal community in alfalfa field with

different standing ages on the rain-fed Loess Plateau[J].

Agricultural Research in the Arid Areas, 2021, 39(3): 162?170

[23]

CHEN Z, LIU J B, WU M N, et al. Differentiated response of

denitrifying communities to fertilization regime in paddy soil[J].

Microbial Ecology, 2012, 63(2): 446?459

[24]

LIU J B, HOU H J, SHENG R, et al. Denitrifying communities

differentially respond to flooding drying cycles in paddy

soils[J]. Applied Soil Ecology, 2012, 62: 155?162

[25]

SHENG R, MENG D L, WU M N, et al. Effect of agricultural

land use change on community composition of bacteria and

ammonia oxidizers[J]. Journal of Soils and Sediments, 2013,

13(7): 1246?1256

[26]

HE M Z, DIJKSTRA F A. Phosphorus addition enhances loss of

nitrogen in a phosphorus-poor soil[J]. Soil Biology and

Biochemistry, 2015, 82: 99?106

[27]

鲍士旦. 土壤农化分析[M]. 3版. 北京: 中国农业出版社, 2000

BAO S D. Soil and Agricultural Chemistry Analysis[M].

Beijing: China Agriculture Press, 2000

[28]

YU Y J, WU M, PETROPOULOS E, et al. Responses of paddy

soil bacterial community assembly to different long-term

fertilizations in Southeast China[J]. The Science of the Total

Environment, 2019, 656: 625?633

[29]

LI Y, WU H N, SHEN Y, et al. Statistical determination of[30]

crucial taxa indicative of pollution gradients in sediments of

Lake Taihu, China[J]. Environmental Pollution, 2019, 246:

753?762

刘时光, 王晓玲, 王元涛, 等. 稻田土壤氧化亚氮产生潜势、

反硝化功能基因丰度和群落结构的垂向分布[J]. 环境科学学

报, 2020, 40(3): 1040?1050

LIU S G, WANG X L, WANG Y T, et al. The potential of

nitrous oxide, denitrification function gene abundance, and

vertical distribution of community structure in paddy soil[J].

Acta Scientiae Circumstantiae, 2020, 40(3): 1040?1050

[31]

ZHAO S Y, ZHOU J M, YUAN D D, et al. NirS-type N2O-

producers and nosZ II-type N2O-reducers determine the N2O

emission potential in farmland rhizosphere soils[J]. Journal of

Soils and Sediments, 2020, 20(1): 461?471

[32]

ENWALL K, THROB?CK I N, STENBERG M, et al. Soil

resources influence spatial patterns of denitrifying communities

at scales compatible with land management[J]. Applied and

Environmental Microbiology, 2010, 76(7): 2243?2250

[33]

潘晓悦, 王晓, 郭光霞, 等. 增温与降水变化对青藏高原高

寒草甸土壤nirS反硝化菌群落丰度和群落结构的影响[J]. 生

态学报, 2017, 37(23): 7938?7946

PAN X Y, WANG X, GUO G X, et al. Effects of increased

temperature and precipitation change on nirS gene abundance

and community structure in alpine meadow soils on the Qinghai-

Tibet Plateau[J]. Acta Ecologica Sinica, 2017, 37(23):

7938?7946

[34]

呼和, 陈先江, 程云湘. 撂荒地亚硝酸还原酶基因nirK和

nirS丰度动态[J]. 草业科学, 2016, 33(7): 1253?1259

HUHE, CHEN X J, CHENG Y X. The dynamics for abundance

of nitrite reductase genes nirK and nirS in abandoned land[J].

Pratacultural Science, 2016, 33(7): 1253?1259

[35]

BA?ERAS L, RUIZ-RUEDA O, LóPEZ-FLORES R, et al. The

role of plant type and salinity in the selection for the denitrifying

community structure in the rhizosphere of wetland vegetation[J].

International Microbiology, 2012, 15(2): 89?99

[36]

HOU S P, AI C, ZHOU W, et al. Structure and assembly cues

for rhizospheric nirK- and nirS-type denitrifier communities in

long-term fertilized soils[J]. Soil Biology and Biochemistry,

2018, 119: 32?40

[37]

HU W G, JIN X T, WANG Y P, et al. Diversity of eukaryotic

micro-organisms and changes in the dominant fungal taxa

composition in relationship with soil environment in the Ebinur

Lake wetland[J]. Biotechnology & Biotechnological Equipment,

2018, 32(2): 408?419

[38]

SZUKICS U, ABELL G C J, H?DL V, et al. Nitrifiers and

denitrifiers respond rapidly to changed moisture and increasing

temperature in a pristine forest soil[J]. FEMS Microbiology

Ecology, 2010, 72(3): 395?406

[39]

LEVY-BOOTH D J, WINDER R S. Quantification of nitrogen

reductase and nitrite reductase genes in soil of thinned and clear-

cut douglas-fir stands by using real-time PCR[J]. Applied and

Environmental Microbiology, 2010, 76(21): 7116?7125

[40]

PETERSEN D G, BLAZEWICZ S J, FIRESTONE M, et al.

Abundance of microbial genes associated with nitrogen cycling

as indices of biogeochemical process rates across a vegetation

[41]

第 1 期 孙鹏洲等 : 黄土高原紫花苜蓿种植对土壤反硝化细菌群落的影响 77

http://www.ecoagri.ac.cn

gradient in Alaska[J]. Environmental Microbiology, 2012,

14(4): 993?1008

BREMER C, BRAKER G, MATTHIES D, et al. Impact of plant

functional group, plant species, and sampling time on the

composition of nirK-type denitrifier communities in soil[J].

Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(21):

6876?6884

[42]

刘若萱, 贺纪正, 张丽梅. 稻田土壤不同水分条件下硝化/

反硝化作用及其功能微生物的变化特征[J]. 环境科学, 2014,

35(11): 4275?4283

LIU R X, HE J Z, ZHANG L M. Response of

nitrification/denitrification and their associated microbes to soil

moisture change in paddy soil[J]. Environmental Science, 2014,

35(11): 4275?4283

[43]

湛钰, 高丹丹, 盛荣, 等. 磷差异性调控水稻根际nirK/nirS

型 反 硝 化 菌 组 成 与 丰 度 [J]. 环 境 科 学 , 2019, 40(7):

3304?3312

ZHAN Y, GAO D D, SHENG R, et al. Differential responses of

rhizospheric nir K- and nirS-type denitrifier communities to

different phosphorus levels in paddy soil[J]. Environmental

Science, 2019, 40(7): 3304?3312

[44]

曹乾斌, 王邵军, 陈闽昆, 等. 不同恢复阶段热带森林土壤

nirS型反硝化微生物群落结构及多样性特征[J]. 生态学报,

2021, 41(2): 626?636

CAO Q B, WANG S J, CHEN M K, et al. The structure and

diversity of nirS-denitrifying microbial community across three

restoration stages of Xishuangbanna tropical forests[J]. Acta

Ecologica Sinica, 2021, 41(2): 626?636

[45]

喻江, 于镇华, IKENAGA Makoto, 等. 施用有机肥对侵蚀

黑土玉米苗期根内生细菌多样性的影响[J]. 应用生态学报,

2016, 27(8): 2663?2669

YU J, YU Z H, IKENAGA M, et al. Effects of manure

application on the diversity of corn root endophytic bacterial

communities at seedling stage in eroded Mollisols[J]. Chinese

Journal of Applied Ecology, 2016, 27(8): 2663?2669

[46]

ZHOU S L, SUN Y, ZHANG Y R, et al. Variations in microbial

community during nitrogen removal by in situ oxygen-enhanced

indigenous nitrogen-removal bacteria[J]. Water Science and

Engineering, 2018, 11(4): 276?287

[47]

胡晓婧, 刘俊杰, 于镇华, 等. 东北黑土nirS型反硝化细菌

群落和网络结构对长期施用化肥的响应[J]. 植物营养与肥料

学报, 2020, 26(1): 1?9

HU X J, LIU J J, YU Z H, et al. Response of nirS-type

denitrifier community and network structures to long-term

application of chemical fertilizers in a black soil of Northeast

China[J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers, 2020, 26(1):

1?9

[48]

XIAO X, LIANG Y T, ZHOU S, et al. Fungal community

reveals less dispersal limitation and potentially more connected

network than that of bacteria in bamboo forest soils[J].

Molecular Ecology, 2018, 27(2): 550?563

[49]

WANG Y, ZHANG R, ZHENG Q, et al. Bacterioplankton

community resilience to ocean acidification: evidence from

microbial network analysis[J]. ICES Journal of Marine Science,

2015, 73(3): 865?875

[50]

78 中国生态农业学 报 (中英文 )?2023 第 31 卷

http://www.ecoagri.ac.cn