基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR
产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定
就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为 25~45 bp，我们建议引物长度为 30~35 bp。一般都是以要突变的
碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了，很可能
会造成突变实验失败，因为引物至少要 11-12 个 bp 才能与模板搭上，而这种突变 PCR 要求
两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少 12 个 bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为 30 bp，接下来需要计算引物的 Tm 值，看是否达到 78℃
（GC 含量应大于 40%）。
（3）如果 Tm 值低于 78℃，则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78℃（GC 含量
应大于 40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm 值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物 GC 含量。
四、引物设计实例
以 GCG→ACG 为例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先设计 30 bp 长的上下游引物，并将 A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’
Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’
（2）引物 GC 含量为 40%，L 为 30，将这两个数值带入 Tm 值计算公式，得到其 Tm=75.5
（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其 Tm 低于 78℃，这样的引物是不合适的，
所以必须调整引物长度。
（3）重新调整引物长度。
Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’
Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’
在引物两端加 5mer（斜体下划线处），这样引物的 GC 含量为 45.7%，L 值为 35，将这
两个数值带入 Tm 值计算公式，得到其 Tm 为 80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的
引物就可以用于突变实验了。
五、突变所用聚合酶及 Buffer
引物和质粒都准备好后，当然就是做 PCR 喽，不过对于 PCR 的酶和 buffer，不能用平
时的，我们做 PCR 把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K，所以要用那些 GC buffer 或扩
增长片段的 buffer，另外，要用保真性能较好的 PFU 酶来扩增，防止引进新的突变。
除了使用基因定点突变试剂盒，如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使
用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTMHS DNA
polymerase。
六、如何去掉 PCR 产物
最简单的方法就是用 DpnI 酶，DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一
般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的
是甲基化缺陷型的菌株），而 PCR 产物都是没有甲基化的，所以 DpnI 酶能够特异性地切割
模板（质粒）而不会影响 PCR 产物，从而去掉模板留下 PCR 产物，所以提质粒时那些菌株
一定不能是甲基化缺陷株。
DpnI 处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板
处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。
七、如何拿到质粒
直接把通过 DpnI 处理的 PCR 产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出
质粒，拿去测序，验证突变结果。
八、图示
九、定点突变操作步骤
[A] 诱导突变基因（PCR 反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及 Muta-direct?酶
进行 PCR 扩增反应，诱导目的基因突变。
1. 设计点突变引物。
[ 注]参考引物设计指导
2. 准备模板质粒 DN A
[注]用 dam+型菌株（例如 DH5α 菌株）作为宿主菌。在 end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效
率没有影响。提取质粒 DNA 时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。 3. [选项]对照反应体系（50μl 反应体系） 10×Reaction Buffer 5μl pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl Control primer mix（20pmol/μl） 2μl dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl dH2O 38μl Muta-direct? Enzyme 1μl 4. 样品反应体系（50μl 反应体系）
10×Reaction Buffer 5μl Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng） 2μl Sample primer (F)（10pmol/μl） 1μl Sample primer (R)（10pmol/μl） 1μl dNTP mixture（each 2.5mM） 2μl dH2O 38μl Muta-direct? Enzyme 1μl 5. PCR 反应条件 [注]按如下参数设置 PCR 扩增条件。 Cycles Temperature Reaction Time 1cycle 95℃ 30sec 15cycle 95℃ 30sec 55℃ 1min 72℃ 1min per plasmid Kb
6. PCR 扩增反应完成后冰育 5 分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。
[注] 按下列提供的 PCR 条件进行扩增，控制 PCR 循环数。注意当突变点位点超过 4 个时会发生突变率降
低的现象。
Mutation Cycles 1~2Nucleotide 15cycles 3Nucleotides 18cycles
[B] 突变质粒选择
PCR 反应结束后使用 Mutazyme?酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒 DNA。
准备 PCR 反应产物
加入 1μl（10U/μl）Mutazyme?酶 37℃温育 1 小时。
[注]当质粒 DNA 用量过多时 Mutazyme?酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突
变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加 Mutazyme?酶用量。
[C]转化
反应完毕后在质粒 DNA 上会产生缺口，当把这个质粒 DNA 转入 E.coli 中时请选择 dam+型
菌株，例如 DH5α。
将 10μl 样品加到 50μl 感受态细胞里，然后放置在冰上 30 分钟。
接下来可以参照一般的转化步骤进行。
序列分析
通常当 LB 平板上出白色菌落则表明发生了突变。
为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。
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