高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总
1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气 10-20 分钟。
3. 打开 HPLC 工作站（包括计算机软件和色谱仪） ，连接好流动相管道，连接检测系统。
4 进入 HPLC 控制界面主菜单，点击 manual，进入手动菜单。
5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的
出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在 manual 菜单下，先点击 purge，再点击 start，冲
洗时速度不要超过 10?ml/min。
6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要
超过 2000。点击 injure，选用合适的流速，点击 on，走基线，观察基线的情况。
7. 设计走样方法。点击 file，选取 select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方
法。若需建立一个新的方法，点击 new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器
等，根据需要而不同。选完后，点击 protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳
流，一般 2-5 分钟；b.基线归零；c.进样阀的 loading-inject 转换；d.走样时间，随不同的样品
而不同。
8. 进样和进样后操作。选定走样方法，点击 start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完
后，点击 postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，
洗掉剩余物。
9． 填写登记本，由负责人签字。
10． 流动相均需色谱纯度，水用 20m 的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引
起气泡。
11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
12． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
13．压力不能太大，最好不要超过 2000 psi。
选择波长要从以下几个方面考虑：
1. 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适
的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测
灵敏度下降。
2. 对各组分都要有适当的吸收。一般是不可能做到的。所以只要选择一个对大多数组分都
有较大吸收的波长就可以了。3. 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。 254nm 对
常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。对饱和基团也有弱的吸收。而对于常见的乙腈、甲
醇的透过率很高。是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。
一、液相色谱流动相的性质要求 :一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测
器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子 k 降低；
而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子 k 升高。因此，k 值是流动相组成
的函数。塔板数 N 一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某
些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸
性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。 ②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相
通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。 ③必须与检测器匹配。使用 UV 检测器时，
所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光
系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。 ④粘度要低（应<2cp） 。高粘度溶剂
会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点
在 100℃以下的流动相。
二、液相色谱流动相的 pH 值
采用反相色谱法分离弱酸（3￡pKa￡7）或弱碱（7￡pKa￡8）样品时，通过调节流动相
的 pH 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相
离子抑制技术。对于弱酸，流动相的 pH 值越小，组分的 k 值越大，当 pH 值远远小于弱酸的
pKa 值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相
中加入少量弱酸，常用 50mmol/L 磷酸盐缓冲液和 1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流
动相中加入少量弱碱，常用 50mmol/L 磷酸盐缓冲液和 30mmol/L 三乙胺溶液。 注：流动相
中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在
这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
三、液相色谱流动相的选择
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的
强度随极性的增强而增加；BR>正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。
反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如
甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有
显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格
低，是反相色谱最常用的流动相。但 Snyder 则推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇
相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外 205nm 处检测的要求，因此，综合
来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统，但价格较贵。
在分离含极性差别较大的多组分样品时，为了使各组分均有合适的 k 值并分离良好，也
需采用梯度洗脱技术。
四、液相色谱流动相的滤过
所有溶剂使用前都必须经 0.45mm（或 0.22mm）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也
不例外（除非在标签上标明"已滤过"） 滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤 。用
膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不
动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶
剂不得用于 HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤
膜。现在已有混合型滤膜出售。
五、液相色谱流动相的脱气
所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响
柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。此外，溶解在流动相
中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂 pH 的变
化，对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高
背景吸收（特别是在 260nm 以下） 导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度 ，并
淋洗时造成基线漂移。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳
香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达 95%。在电化学检测中（特别是还
原电化学法） 氧的影响更大。 ，
除去流动相中的溶解氧将大大提高 UV 检测器的性能， 也将改善在一些荧光检测应用中的
灵敏度。超声脱气比较好，10-20 分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气
是足够了，此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻
璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
六、液相色谱流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多
有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如
用于 HPLC 系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，
也防止氧和二氧化碳溶入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用。
如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在短期内使用完毕。如果是紫外检测器的话将检测波长设
高点，对于甲醇-水体系，在 254nm 下检测就不会有问题了！
高效液相色谱仪使用注意:
1. 色谱柱中的流动相会排干吗？
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的
流动相吸干了，HPLC 系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱
柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，
并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能
输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的
密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能
只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即
使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的
溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；
已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以 1mL/min 的流
速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
HPLC 使用注意事项
1.流动相必须用 HPLC 级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用
0.45um 或更细的膜 过滤)。
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。
3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇
(或甲醇水溶液)冲 洗 40 分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须
用去离子水冲洗 20ml 以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该
用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.C18 柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。
8.堵塞导致压力太大，按预柱?混合器中的过滤器?管路过滤器?单向阀检查 并清洗。
清洗方法；①以异 丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；⑧用 10％稀硝酸清
洗。
9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。
11.要注意柱子的 PH 值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相
中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
流动相：
1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过
滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过 2 天） 防止长菌变质； ，
3、 使用双泵时，A、B、C、D 四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则 A、D（进液
口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；
A、B、C、D 四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。
样品：
1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比
流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液； 手动进样时，进样量尽量小，
使用定量管定量时，进样体积应为定量管的 3～5 倍；
色谱柱：
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如 pH 值范围、流动相类型等；
2、使用符合要求的流动相；
3、使用保护柱；
4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如 5％甲
醇水溶液） ，再用甲醇冲洗。
5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、不要高压冲洗柱子；
7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；
使用过程中注意轻拿轻放。
液相色谱柱使用经验谈
色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化
的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；
另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳
条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用 0.45 祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目
的，因此要求流
动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中 (或长时间保留在柱
中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱
压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收
较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，
还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
2、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不
同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为 4.6mm
的色谱柱，流速一般选择 1ml／min，对于内径为 4.0mm 柱，流速 0.8ml／min 为佳。 当选用
最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使
用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意： a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为 30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己
烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于 18 兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，
有可能影响分析结果。
c．含水流动相最在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加
入叠氮化钠，防止细菌生长。
d．流动相要求使用 0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱
性能
高效液相色谱常见故障的断定及解决诊状 可能的原因 解 决 方 法
(一)保留时间变化
1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用 10 倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L 的缓冲液
4.柱污染 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 采用保护柱
(二)保留时间缩短
1.流速增加 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 降低样品量
3.键合相流失 流动相 PH 值保持在 3"7.5 检查柱的方向
4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 柱恒温
(三)保留时间延长
1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化
3.键合相流失 同前(二)3
4.流动相组成变化 同前(二)4
5.温度降低 同前(二)5
(四) 出现肩峰或分
1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的 15%
2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 更换色谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 更换进样器转子
(五)鬼峰
1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 处理样品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对色谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用 HPLC 级的水
(六) 基线噪声
1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用 HPLC 级试剂
3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相 PH 值,钝化样品
4.同前(四)4
5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的
连接管
7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
1.进样体积过大 同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于 10 点
4.检测器时间常数过大 设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的 10%
5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 用小体积池,卸下热交换器
7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载 进小浓度小体积样品
操作过程：
1、 开机操作：
（1） 、打开电源，用 Harb 相连接时，注意 Harb 电源，打开计算机，打开 Bootp Server（一
般启动时已打开） ；
（2） 、自上而下打开个组件电源，Bootp Server 里显示有信号时（有六行字符） ，打开工作
站（先打开 On line） ；
（3） 、打开冲洗泵头的 10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽） ，控制流量大小，以能流出
的最小流量为准；
（4） 、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗
泵溶液的体积，及时加液；
（5） 、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。
2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗 20
分钟以上再换上含盐流动相） ，正式进样分析前 30min 左右开启 D 灯或 W 灯，以延长灯的使
用寿命；
3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的 Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验
结果；
4、 使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般
选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒 3 遍以上，并排除针筒中的气
泡；
5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长
菌时，不可用超声洗涤，可用 5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；
6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路 30 分钟以上，再用甲醇冲
洗。冲洗过程中关闭 D 灯、W 灯；
7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪
各组件，关闭洗泵溶液的开关；
8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。
未经操作培训，不得擅自使用仪器。
常见故障排除：
1、 操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。当出现错误警告（各组
件指示灯均为红色） 般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点 ，一
击 On line 操作界面中的 Instrument/System Off， 后再点击操作界面中的 Instrument/System On 然
即可。
2、 连接柱子与管线时，应注意拧紧螺丝的力度，过度用力可导致连接螺丝断裂。柱接头
处易发生漏液，可能情况为接头 Fittings 中间的管子未和接口处贴紧。不同厂家的管线及色谱
柱头结构有差异，最好不要混用，必要时可使用 PEEK 管及活动接头；
3、 操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法
检查，确定何处堵塞后解决。若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙
醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡） ，若还是无法通畅，则需换柱；
4、运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；
5、 样品瓶中样品较少，自动进样器进样针无法到达液面，可采用调低进样针进样高度的
办法，注意设置时不要使进样针碰到瓶底，微量样品分析应使用微量样品瓶；
6、 自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位。
7、 泵压不稳或流量不准，可能为柱塞杆密封圈问题或 seal wash 垫圈问题，需更换；
8、 基线产生不规则噪声，可能原因为系统不稳定或没达到化学平衡（使其平衡，若用离
子对试剂，在首次使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡） ，流动相
被污染（更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统） ，色谱柱被污染（为证明
可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱） 测器不稳定； ，检
9、 短期有规则的噪声，可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当（如两种溶剂的
互溶性问题） 入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定； ，泵
10、 长期有规则噪声，可能原因为室温不稳（未使用柱温箱）或使用柱温箱不当；
11、 基线漂移，可能原因为系统不稳或没有达到化学平衡，室温不稳（未使用柱温箱） ，
流动相污染或分解，柱污染，检测池泄漏，系统泄漏，固定相流失（另选流动相，另选色谱
柱） 测定的波长选择错误（对溶剂有吸收）
， ，样品组分保留太长（用强度合适的溶剂清洗色
谱柱） 测器不稳定； ，检
12、每次进样时的保留时间不重复，可能原因为系统不稳或未达到化学平衡，由于气泡、
各部件磨损等原因引起的泵压或泵脉冲输液不稳定，进样体积太大或样品浓度太高平衡被破
坏，溶剂配比不合适，柱被污染；
13、无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；
14、色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题（瓶号错、
进样体积不合适、进样错误、针头堵塞） ；
15、峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或
连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏） ，
柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化；
16、出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱性能下
降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高（样品过载） 平衡破坏； ，
17、前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载） 平衡破坏，对于流 ，
动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱） 柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效； ，
18、脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题（如
阀漏等） ，检测器时间常数设置错误；
19、 出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进
样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有
稳定剂/稳定剂变化。
(一)涡流扩散(Eddy diffusion)流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡
流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快;有的部位结块或装
直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，
装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。
(二)分子扩散(Molecular diffusion)分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域
运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作
时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。
(三)质量转移(Mass transfer)被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的
区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均
需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非
平衡移动，使区带变宽。
（四）动相流速当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论
塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大
则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但
在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速咖大会降低柱
效率。
（五）固定相颗粒大小定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压
力才能使它流动。
1、开泵后压力即升高至最高限度，经过对色谱柱前，色谱柱，色谱柱后的分段测试，确
定为检测池堵塞。
2、换检测波长后，色谱峰面积比以前做的小很多，怀疑进样环或管路漏夜，经检查，排
除，最后确定为，检测波长的显示值和实际值不符。由气味、景象和声音可以发现的问题你
需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的
感官(除了味觉)来"感觉"你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。
例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。
流动相选择秘诀
1、对于一般的反相柱，用甲醇/水或乙腈/水作流动相。甲醇/水作流动相时，如果得到的色
谱图出的峰分的不完全，可以加大水的比例。如果出的峰太靠后而分离效果又不错，可加大
甲醇的比例，可使出峰变早。对于一些难分离的物质，要选用乙腈/水作流动相。
2、秘诀 1:由强到弱： 一般先用 90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试 验， 这样可
以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。
秘诀 2:三倍规则 ：每减少 10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加 3 倍，此为
三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。
秘诀 3:粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂 10%的改变量调整为 5%，并据
此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。
3、含缓冲盐的流动相最好当天用完，不要留置过夜，用不完也要倒掉，这是为了保护好
机子起见，流动相的保存期限与缓冲盐的浓度有关系，越浓越不宜保留，总之，我认为缓冲
盐溶液都不宜保留超过 24 小时，HPLC 用缓冲盐时,由于泵头内的缓冲盐溶液存在高压析盐现
象,析出的细小盐粒非常坚硬,它附着在蓝宝石活塞杆上,随着蓝宝石活塞杆的往复运动,容易产
生划痕,并磨损密封垫,造成漏液等故障现象。
高效液相色谱中常遇见的问题及处理方法
1 .色谱柱跑干了，处理方法：将贮液瓶装入重蒸水，首先按 purge 键，将柱前气柱排出，
若无法排出，可将色谱柱前拆下，用注射器抽吸。待柱前气体排空后，连接色谱柱，用水高
低流速交替冲洗色谱柱，直至柱压稳定为止。
2.基线不稳，有静电，处理方法：检查接地是否良好。
3.峰面积变化非常大，处理方法：检查是否进样阀堵塞。
4.基线突然提高，变粗，处理方法：检查样品池能量，若低于正常值，说明检测器污染。
5.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。高低流速交替冲洗。
6.柱效或峰形突然变差，处理方法：更换预柱。
7 塔板数低：色谱柱选择不对，二次保留、峰形不好的影响
8 色谱柱易变性：色说柱选择不对，二次保留的影响
9 色谱柱寿命短：色谱柱选择不对，样品需预处理(PH<3 或 PH>7)
10 保留值变化：色谱柱平衡不够，流动相比例改变
11 出现新的干扰峰：初始分离不够或初始样品无代表性
柱的使用和维护注意事项(推荐)色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱
效、缩短使用寿命甚至损坏。在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉
下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时
应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述） 。
○ 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水， 2.
反之亦然
③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱
头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相（尤其是 pH） ，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面
连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"
饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流
动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的 20 倍左右，即常规
分析需要 50"75ml。
下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）
依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略
最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射
100"200 祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去
类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去
蛋白质污染。
⑦ 保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁
止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
⑧ 色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或
将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰
变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净
小钢将柱头填料取出 1"2mm 高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当
溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得
到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析
柱相同固定相的短柱（5"30mm） ，可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一
定的柱效，这是值得的。 通常色谱柱寿命在正确使用时可达 2 年以上。以硅胶为基质的填料，
只能在 pH2"9 范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，
特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填
料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力
强的洗脱液冲洗，例如 ODS 柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使
用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，
不宜长期与之接触。装在 HPLC 仪上柱子如不经常使用，应每隔 4"5 天开机冲洗 15 分钟。 |
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