白细胞介素-2活力检验的意义，方法和问题

白 细胞 介素-2 生理 活 性检 验的 意义 ， 方法 和 问题
河南省 肿瘤研究院
赵承彦
白细胞 介素-2 （IL-2） 是由 活化的 辅助 性 T 细 胞分 泌 的一种 细胞 因子 ， 是 调节 免疫功 能
的重要 活性 物质 ， 主 要提 高集体 免疫 杀伤 反应 能力 ， 是 目前 应用 较多 ， 社 会 效益较 大的 一种
细胞因 子 。IL-2 生理 活性 检验具 有重 要意 义。 传统 IL-2 活性检测 方法 都 是 检 测促细 胞生 长
增殖活 性， 不 是 检测 细胞 免疫杀伤 反应 功 能活 性。
1.IL-2 促细胞增殖活性检 验方法
3
IL-2 促细胞增 殖 活性 检验 方法 以 H-TdR 标记 方 法 为 代表 ， 随后有 MTT 等染 料 标记法 ，
基本原 理都 是 用 CTLL-2 细胞 做 IL-2 激活的 靶细胞 。 CTLL-2 是对 IL-2 依赖性 生 长的细 胞珠 。
一定量 的 CTLL-2 与不同 剂量 的 IL-2 共培养， 然后 检测 CTLL-2 增值率 ， 画 出 一条剂量 ～ 效
应 曲线 ， 在 图上 用划 线法 确定 EC ， 与标 准样 品曲 线 EC 比 较确 定 IL-2 活性 。
50 50
3
H-TdR 和 MTT 方法， 都 是通过 标记 细胞 ， 检 测标 记物量 值变化 计 算细 胞增 值率。 增殖
率 与标 记物 的吸 收利 用 相 关， 标记 物 有 没有进 入细 胞内 ， 有 没有 被吸收 利用 ， 未 见有 文献 验
证确定 。MTT 方 法， 显微 镜下可 以看 到 细 胞表 面 很 多燃料 颗粒 ，即 使洗 涤几 次也不 能完全
3
清除 。H-TdR 也不 排除 吸 附现象 。 活 细胞 和死 细胞 都可以 吸附 ， 标记 方法 存 在假性 增殖 （假
阳性） 。 两种 方法 虽然 测出 了剂量 效应 表现 的 S- 曲线 ， 因为 不会 解析 S- 曲线， 实验结 果含 有
的基本 信息 没有 表述 出来 。 用 ED 标定 IL-2 活性单 位 也不 体现 检验 样品 的功 能属性 。
50
本文 介 绍 了 一 个 IL-2 活 性 检 测 方 法 ， 叫 做 极 限 稀 释 细 胞 克 隆 形 成 实 验 方 法 （limiting
dilution clone formation assay, LDCFA ） 既能用 于检 测 细胞增 殖活 性， 也能 用于 检测细 胞杀 伤
免疫活 性 。LDCFA 不用 标 记细胞 ， 不 用标 准品， 用 标准 S- 曲线 定义 IL-2 活性单位， 意义 明
确 ，标 准统 一， 简单 实用 。
1.1 LDCFA 原理
1.1.1 LDCFA 实验体系
LDCFA 也 用 CTLL-2 细胞做检测 细胞 ， 用 CTLL-2 细胞增 殖率 （growth ratio ，GR ）做
检验指 标。GR 根据 细胞形 成的克 隆计 算 ， 细胞 增殖 才能形 成克 隆， 没有 假阳 性。
[1]
LDCFA 根据极 限稀 释分 析 方法(limiting dilution assay, LDA) 原理， 将 CTLL-2 细胞做
极限稀 释， 使每 个克隆培养 单位 里平均 1 个细 胞， 与 不同 剂量 （Dose, D ） 的 IL-2 混合构成
i
培养体 系 。 D 表示为 ng/ml. 一个剂量 组 有多个 克 隆单 位 （50 左右 ） 。 培养 3 ～5 天后， IL-2
i
无活力 CTLL-2 细胞 不形成 克隆 ；IL-2 剂量 浓度 低 ， 活 力低 ， 部分 细 胞形 成 克隆 ； 剂 量浓 度
增高， 活力 增高 ，克 隆增多 。培 养体 系只 有 培 养基 ，CTLL-2 细胞和 IL-2。细胞增殖 才能 形
成克隆 ， 一 个克 隆单 位里 平均 有 一个 细胞 ，所以 克隆 单位 数等 于 增 殖的 细胞 数 。
1.1.2 LDCFA 用有 或无计数方法定量细胞变化
LDCFA 用 GR 做 检验 指标 。GR 真实 准确 检验 得到 的 IL-2 活力 才会 真实 准确 。GR 是
CTLL-2 细胞变化 率， 细胞 计数准 确，GR 才 会真 实准 确。LDCFA 计数 细胞 的方 法是把 计数
细胞转 换成 计数 克隆 ， 计 数克隆 比计 数单 个细 胞容 易 且准确 。LDCFA 设定一个 IL-2 剂量 有
1

??????????????????????????



多个（n=50 左右 ）克 隆单位 。 虽 然一 个克 隆单 位里 平均一 个细 胞， 但不 会每 个单位 里都 是
一个细 胞， 有的 可能 没有 细胞， 有的 可能 是 1 个， 或 2 个 ， 或 3 个 细胞 。一个 IL-2 剂量组
有 n 克 隆单 位， 每个 克隆 单位 里 有的有 克 隆， 有的 没有， 平均 一个 单位 里的 克隆数 ， 称 为克
隆均数 （ ?）。 一个 单位 里的 克 隆均 数等 于 能增 殖的细 胞 均数 ，因 此 将计 数细胞 变 成计 数克
隆。 计 数克 隆 比 计数 细胞 容易 。 多个 细胞 聚集 成的 克隆， 显微 镜下 很容 易辨 别， 所以 不 用标
记细胞 ，可以 直 接计 量细 胞变化 。
极限稀 释可 以使 克隆 单位 内平 均 1 个 细胞 ， 但 不会 每个单 位内 都 是 1 个 细胞 ， 具体 有多
少单位 里是 1 个 细胞 ，有 多少单 位里 是 0, 2, 3, … 细胞， 遵循 Poisson 分布 规 律。 Poisson
分布表 示为 (L-1) 式 ，
? ?
? e
P( ) = …… (L-1)
!
是单位 内的 细胞 数， P( ) 是单位 内有 细胞 的概 率，μ 是 单位 内 细 胞均 数。
如果令r 为单 位内 有 细胞的 克隆单 位数 ，n 为克 隆单 位数， 则
r r
0
P( ) = , P(0)=
n n
? ?
当 =0 时 ， P(0)=e , 两 边 取对数
r
0
μ= ? ln P(0) = ?ln …… (L-2)
n
(L-2) 式是 Poisson 概率 分 布函数(x=0) 的一 种特 殊形 式， 表 示阴 性克 隆单 位概 率 的负对数
等于单 位内 细胞 均数( ?) 。 根据这 一属 性， 实验 只需 计数克 隆阴 性单 位数(r ) ， 由克隆 阴性 单
0
位概率计算 单位（克隆 ） 均数和 细胞均数( ?) 。 有了 ? 和单位 数 n，也就有了 增殖细胞总数 。
阳性克 隆比 较复 杂 ，单 位 内的阳 性克 隆会 有 1 ，2 ，3，... 细胞多 种情况 ， 克 隆阳性 单位 只
用作鉴 别阴 性单 位 ，而 不 管单位 内是 几个 克隆 多少 个细胞 ， 都是 阳性 单位 。 于是 LDA 将增
殖 细胞 计数 变成 了 有 或无 克隆单 位计 数， 所以 简单 而 准确 。
由(L-2) 式计算 μ 有误 差。 由误差 理论 导 出 μ 的误 差 公式，
( )
?lnP 0 ?
2
μ 的方差 S = =
2 2
nr nr
0 0
( )
?lnP 0 ?
误差 S = = …… (L-3)
√
? 2 √ 2
(n?2)r (n?2)r
0 0
1.1.3 LDCFA 用 预置条件控制实验误差和可信度
LDCIA 是一个 统计 学实 验 方法， 实验 结果 的可 信度 和实验 误差 与样 本数 有关 。(L-2) 式
表明 ， 细 胞均 数 μ 的 误差 决 定于 μ ， r 和 n ， 根据 S 和 n 应用 方差 分析 可以 计算μ 的可信 度；
0 0 ?
i
反过来 ，确 定了 置信 限和 误差也 可以 计算 单位 数 n 。细胞 稀释 极限 值（μ ） 与克隆 单位 数 n
0
可以选 定。 极限 稀释 分析 方法原 理限 定 μ ≌1；公式(L-1) 要求 r 必须大于 1 ，优选 值≥10。
0 0
如果选 定克 隆单 位 数 n，S 和置信 限也 就确 定。 表 L-1 是以 满足 95% 置信 限概 率 P ’ 为标
? (n ,0.95)
准，计 算确 定的 ? , n 与 r 之间的 匹配 值。 应用 表 L-1 根据 实 验 要 求 的 r 和置信限，可以选
0 0 0
定 ? 和 n 值 。表 中数 值表 明：1 ）理 想的 实验 条件 要 求置信 限 P ≥95% ，r ≥10， 至少
’
0 (n ,0.05) 0
需要 n?36. 2 ） 如果 希望 n 在 100 以内 ， ? 值应 小 于 2.0. 3 ）如 果选 择 ? =3 ，需 要 n?180 。
0 0
LDCIA 根据 表 L-1 选定 ? 和 n， 实验 获得 的 ? 可信 度大 于 95% 。单 位数 越多 ，实验 结果 越
0 i
准确， 可信 度越 高。
2

????????



表 1.1 极 限 稀 释 法 中 n 与 μ, r , P (%) 的 匹 配 关 系 表 （ 引 自[…] ）
0 0 (n’0.95)
?0=0.5 ?0=1.0 ?0=1.5 ?0=2.0 ?0=2.5 ?0=3.0
P0.5(0)=0.6065 P1.0(0)=0.3679 P1.5(0)=0.2231 P2.0(0)=0.1353 P2.5(0)=0.0821 P3.0(0)=0.0498
n t(n’0.05) r 0 p(%) r0 p(%) r0 p(%) r0 p(%) r0 p(%) r0 p(%)
32 2.042 19.41 94.85 11.77 94.04 7.14 92.14 4.33 89.15 2.63 84.78 1.59 78.73
36 2.034 21.84 95.68 13.24 95.00 8.03 93.38 4.87 90.81 2.96 87.01 1.79 81.65
40 2.025 24.26 96.31 14.72 95.73 8.93 94.33 5.41 92.10 3.28 88.77 1.99 83.89
44 2.019 26.69 96.80 16.19 96.30 9.82 95.07 5.95 93.11 3.61 90.16 2.19 85.90
48 2.015 29.11 97.21 17.66 96.74 10.71 95.67 6.50 93.93 3.94 91.29 2.39 87.45
56 2.006 20.60 97.42 12.50 96.56 7.58 95.15 4.60 93.01 2.79 89.84
64 1.999 14.28 8.66 96.02 5.25 94.24 3.19 91.58
72 1.997 97.18 9.74 96.65 5.91 95.14 3.58 92.86
96 1.989 12.99 97.82 7.88 96.81 4.78 95.28
104 1.986 8.54 97.17 5.18 95.80
120 1.980 9.85 97.71 5.97 96.60
152 1.960 12.48 98.40 7.57 97.62
200 1.960 9.96 99.98
P0.5(0) 为? =0.5 时 克隆 阴性 单位 概率 ，其余 类同 。P(%) 为 置信 限概 率。
0

1.1.4 LDCFA 实验数据获取方法
LDCFA 定义 GR 为? 与 ? 的比 ， ? 是 加入 到克 隆 单位里 的 细 胞均 数， ? 是 克隆 单 位
0 i 0 i
里的 细 胞均 数。
?
i
GR = （% ） …… (L-4)
?
0
2
? ? ?
1
i i 0
√
S = … + ( ) …… (L-5)
CIR
2 2
?
r ? r
0 i 0
0
实验数 据是 各剂 量D 对应克 隆单位n 里的 阴性 单位 数r ，用 L-2 式转换成 克 隆均 数 ? ，
i i i0
i
再 用 L-4 式转换 成GR . D 和GR 通常 先列 出数 据表 如 表 S-1。 表 S-1，y 和y 是两样 品的 实
i i i 1 2
验值 ，y 对照 实验 值不 为 0 ， y 是y 去对照 实验 值 后 的数 据。
2 21 2
表 S-1 LDCFA 实验数据列表（D 单位为 μ mole/ml, μg/ml ）
i
D 0.0 0.625 1.25 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5
i
y r 40 39 48 43 35 25 21 23 26
1
i0
n 40 40 50 50 50 50 50 60 70
i
? 0.0 0.02 0.041 0.1426 0.3532 0.6806 0.8685 0.9567 0.9869
i
GR 0.0 2.0 4.09 14.26 35.32 68.06 86.85 95.67 98.69
i
y r 35 36 35 38 37 27 29 27 54
2 i0
n 38 40 40 48 54 48 62 64 60
i
? 0.0824 0.1022 0.1324 0.2356 0.3781 0.5698 0.7598 0.8630 0.910
i
GR 8.24 10.22 13.24 23.56 37.81 56.98 75..89 86.30 91.00
i
y GR 0.0 1.98 5.0 15.32 29.57 48.65 67.65 78.06 82.76
21
i

1.2 LDCIA 实验 结果 分析 方法
为 书写 方便 ，GR 用 表示，D 用 表示。 与 在二维坐标 图 上表现 为一 条 S- 型曲线
i i i i
i i
3

????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????



如 图 S-1。 剂量 ? 效应曲 线 或为完 整 的 S- 型曲线， 或 为 S- 型曲线 的一 部分， 解析 S- 型曲线 获
得 IL-2 活力的性能 指 标。
1.2.1 S-型曲线表述方法
S- 型曲线可 以用 图形 表示 ，也可 以用 数学 公式 表示 。 公式 （S-1）是 经典 的 S- 型曲
线方程 ， （S-2 ）式是 其反 函数形 式，图 S-1 是 根据 公式用 设定 的常 数画出 S- 型曲线 图 。
1
= ...... (S-1)
?????
+
1
r ? = ...... (S-2 ）
?
+

图S-1 标准S- 型曲线
y 图 S-1 标准 S- 型曲线。 常数决定 曲线
1.1
1
形态： y ：a=1 ，b=9 ，k=1 ；y ：a=1 ，
-1 -2
0.9
0.8

b=1 ，k=1 ：y ：a=2 ，b=1 ，k=1 ：y
-3 -4
0.7
0.6
是 y 的反函数，r=1 ，取-3 ?x ?8 区间
0.5 -1
0.4
Y-1

0.3 数值，带入(S-1) 和(S-2) 式计算y 值，用
Y-2 i
0.2
Y-3
0.1
?y 绘制的 S 曲线图。y y 和 y 是上
i -1 ， -2 -3
i
0
x
升曲线，y 是下降曲线。
-3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 -4


S- 型曲线方 程是 一个 三元 一次方 程， 和 是变量 ， k 、 a 、b、r 是决 定 S- 曲线 形态的
常数 。S- 型曲线 方程 有如 下特性 ，
1 1
? ? 时， S- 型曲线 有极 大值 ， y = ； = 0 时， y = ， 为纵 坐标 截距 ； ? ? 时，
max 0
a a+b
1
S- 型曲线反 函数 有极 小值 ，y=0 ，代入 （S-2）式 ，r =
a
1.2.2 S-型曲线解析 方法
(S-1) 是个三元 一次 方程 ， 有 3 个常 数， 解方 程 有 难 度， 所 以没 有得 到应用 。 本文依据
[..]
S- 曲线和生 物反 应特 有的 属性 将 S- 曲线方 程转 换成 线性方 程 ， 化 解了 解三 元 次方程 的难 题
(S-3) ，(S-4)是（S-1）和(S-2） 转换 后的 线性 方程。 解析 S- 型曲线 就是 将实 验值 和 代入 方
程（S-3 ）或(S-4）求解常数（a ，b，k）， 将 常数 值 代入原方程 得到表示 样本 属性的 S- 型曲
线 方程 。 表示 样本 属性 的 S- 型曲线方 程是 解析 样本 性能的 工具 。a 是实 验设 置 值， 决定 曲线
的幅度 ， 不影 响曲 线和 样 本性能 ，a 等 于极 大值y 的倒 数， 根据 实验 条件 确定 ， 本例GR 最
max i
大值 100% ，a=0.01. 也 可以 取极大 值 为 1 ，a=1.有了 a 值将实 验数 据代 入方 程做 回归计 算即可
得到 b 和 k 。
?1
lny = ln(y ? a) = lnb? k = ? ???? ......(S-3)
?1 2 ?1
[( ) ]
lny = ln r ? y ? a = lna b + k = + ???? ......(S-4)
方程式(S-5) ～(S-7)是用 表 S-1 中y 和y 两个 检验 样品 实验 数据做 的计 算,
1 2
?1
lny = ln( ? 0.01) = lnb? k = 0.1901 ? 1.2155 ……(S-5)
1
?1
lny = ln( ? 0.01) = lnb? k = ?1.9620 ? 0.6708 ……(S-6)
2
?1
lny = ln( ? 0.01) = lnb? k = ?0.6820 ? 0.7986 ……(S-7)
21
4


??????????????????????



方程式(S-8) 是标 准 S- 曲线 ，常 数 a=1，b=1 ，k=1 是 设置值 ，用 作参 照标 准， 最大值 取
100% ， 常数 a=0.01 ，
?1
lny = ln( ? 0.01) = ln1? k = 0.0 ? 1 ……(S-8)
0
应用方 程式(S-5) ～(S-8) 很 容易计算 体现 样 本属 性 的 实验参 数， 列于 表 S-2。

表 S-2 S- 型曲线参数表现的样 本性能及其相互关系
b k ED50 ED90 RDE50-90 RDE50…90 RDE50…90/RDE50-90

y 1.0 1.0 4.6052 6.8024 18.2050 19.5451 1.07361
0

y 1.2094 1.2155 3.9451 5.7528 22.1279 23.7572 1.07363
1
y 0.1406 0.6709 3.9403 7.2157 12.2117 13,1108 1.07363
2

y 0.5210 0.7986 4.9126 7.6639 14.5383 15.6089 1.07364
21


1.3 样本性 能表 述方法
IL-2 活力检验 目的 是 为 了 应用， 如何 根据 实验 结果 形成的 S- 曲 线解 析和 表述 Il-2 性能
与活力大小？ 传统方法存在很多问题。IL-2 活 力是用活力单位（IU ）表示的，活力单位 的
含义 和 定义 并不 明确 。下 面解 析 IL-2 活力单位 的真 实含义 与表 述方 法。
1.3.1 IL-2 促细胞增殖活力与 活力单位 的定义
IL-2 活力单位 IU 是怎么 定义 的呢？ 文 献报 告 是 用检 验样品 与标 准样 品在 同样 条件下 检
测剂量 效应 曲线 ，以 标准 样品曲 线 ED 表示 的 IU 值为依 据标定 检 验样 品的 IU 值。但 IU
50
的 生 理学 含意 是 什么 ？1 IU 的活 性值 多大 ？ 标准 样
图S-2 LDCFA 实验形成的S- 型曲线
y
品的 IU 值 如何 确定 ？有关 组织 及 WHO 都没 有说 清
100
楚。 用 ED 标定 IL-2 活力大小 是 认为 ED 决定 IL-2
50 50
90
80
性能，ED 相同，活力一样 。 这 种 认 识 不对 ， 如 图
50
70
S-2 ，y 和y 两条 曲线 ED 相 同，性 能 与 活力 显然 不
1 2 50
60
相同 。ED 只 是一个 剂量 点， 一点 决定 不了 一条 直 线 50
50
y-0
40
的位置 方向 ， 两点 决定 一 条直线 的位 置方 向 ， 多 点 决 y-1
30
Y-2
定一条 曲线 的位 置方 向 。 确定一 条曲 线的 性能 应该 用 20
Y21
10
多个剂 量效 应值 界定 。S- 型曲线 上有 无数 个剂 量效 应
0
值，如何 选择 表述 样 品性 能的 实 验参 数呢 ？
0 1 2 3 4 5 6 7 8
x


S- 型曲线是一个 中心 对称 曲线， 中心点 在 处，
50
有两个 拐点 ，分 别在 和 处。 斜率 k 体现 样本 性能 ， 但 k 的生理 学意 义 不 太明 确，表
10 90
S-2 列出了几个体现样本性能的 S-曲线参数及其相互关系 。 单 位 剂量效应比 率 （Radio of
Dose-Effect, RDE ） 表示 每 单位剂 量产生 的 效应 值 。RDE 定义 为剂 量区 间效 应差 与剂量 差之
比。 如 RDE=(y ? y ）?(ED ? ED ) 。RDE 与 k 相关 ， 能 较好 地 表 示样 本性 能。但 RDE
90 50 90 50
是 个剂 量区 间的 平均 值， 对于直 线 等 价于 k， 对于 曲线不 完全 等价 于 k ，划分 多个 区间 计算
RDE ， 越多 越接 近 于 k ， 积分计 算 值 等价 于曲线 k ，如表 S-3 所示 。 多区 间 和积分 计算 比较
麻烦， 能不 能用 一个 单剂 量区间 的 RDE 表示 样本 性 能 呢？
表 S-3 表明 ， 曲 线不 同剂 量 区间 的 RDE 不 相同 ， 距 离ED 越远 RDE 越小 。 多 区间 RDE
50
平均值 与 单 区间 的 RDE 比率 是一 个定 值， 与曲 线形 态和样 品性 能无 关 ， 所有 S- 曲线比率 相
同 ，最 大差 值 1.084 。 因 此 可以 用 最大 差值 作为 一系 数与 单 区间 的 RDE 相 结合 表示 IL-2 活
5




力 ，活力 大小=1.084RDE 。 活力大小只是一个比率，生理学 意义不明确，需要 有一个 生理
学意义 明确 的 活 力单 位 。 该检验 方法 用标 准 S- 曲线 定义 IL-2 活力单位 U 。

表 S-3 多区间 与单区间 RDE 之 间的关系
y y y y
0 1 2 21
区段 RDE RDE RDE RDE
1 区段 ED ?ED 18.2050 22.1276 12.2117 14.5383
50 90
4 区段 ED ?ED 24.6630 29.9779 16.5440 19.6959
50 60
ED ?ED 22.6330 27.5104 15.1822 18.0747
60 70
ED ?ED 18.5530 22.5512 12.4453 14.8164
70 80
ED ?ED 12.3315 14.9890 8.27198 9.84795
80 60
合计 78.1805 95.0284 52.4434 62.4350
均值 19.5451 23.7571 13.1109 15.6087

RDE /RDE 1.07362 1.07364 1.07363 1.07363
4 1
40 区段 合计 788.131 957.948 524.383 629.392
均值 19,7033 23.9487 13.1096 15.7348

RDE /RDE 1.08023 1.08023 1.08023 1.08023
40 1
多区段积分 19.7342 23.9863 13.2375 15.7595

1.0840 1.08399 1.08399 1.0840
RDE /RDE
n 1

以标准 S-型 曲线 性能 参数 为依据 ，定义 在标准实验 条件下，1ng/mlIL-2 样品 产生 1%
效应值 （1%CTLL-2 增殖）的活力为1IU。
标准实验 条 件可 以协商 制 定。 我 们的 实验 条件 是由 无 血清培 养基 GT-551,CTLL-2 和 IL-2
构成的 培养 体系 ，饱 和湿 度，5%CO ，37℃ ， 培养 5 天。 克隆单 位内 有 2 个 以上细 胞聚 集
2
在一起 为 1 个克 隆， 1 个 克 隆为 1 个增 殖细 胞。 血清 里 会含 有 IL-2， 培养体系 内不 能有血 清，
也可以 用标 准样 品做 标准 S-曲线 ，用 来定义 IU ，但 是标准 样品 很难 做出 标准 曲线， 而
且 标 准 样 品 运输 和 储 存 过程 中 性 能 会 改变 ， 用 标 准品 标 定 活 力 单位 意义不大。如果 以 标准
S- 型曲线作为标准样品曲 线 来定义 活力单位，恒 定 不变 ，既科学又 实用 。只 要检测出 S- 型
曲线 ， 计 算出 RDE 即可 标 定活力 单位 。 标准 样品 曲线 （y ） 给出ED =4.6052 ， 表示 在ED 的 位
50 50
0
置 4.6052ng/mlIL-2 样品产生 50% 的 效应 ， ED =6.8024 ， 表示在ED 的位 置 6.8024ng/mlIL-2
90 90
样品产 生 90 % 的 效应。RDE=18.2048 ， 表 示该 样品 1ng/ml 产生 18.2048% 的效 应 。 这是 单区
间计算 的 RDE ， 真实 活力 为 1.084XRDE=1.084X18.2048=19.7340IU 。 单 区间ED ～ED 位于
50 90
S- 曲线的上 半部 ， 与 下半 部 （ED ～ED ） 对称 ，RDE 体现 S- 曲线属性 ， ED ～ED 区间
10 90 50 60
的 RDE 与 之不 同 。
应用实 验获 得 的 S- 曲线很 容易计 算出 检验 样品 的 活 力， 如
y 样品活 力，1.084RDE=1.084X22.12796=23.9867IU/ng/ml ，23986.7IU/μg/ml
1
y 样品活 力，1.084RDE=1.084X12.21169=13.2375IU/ng/ml
2
y 样品活 力，1.084RDE=1.084X14.53834=15.7596IU/ng/ml
21
1.3.2 IL-2 性能的表述方法
IL-2 生理性能 检验 ，目的是为了 应用 ，掌握 了 IL-2 样品属性 才会 应 用， 让用 户正确 掌
握 IL-2 属性，需 要将 IL-2 的性能 正确 表述 出来 。 解析剂 量效 应曲 线获 得的 实验参 数 b，k，
6




ED ，ED ，RDE 与活 力大 小， 体 现样品 属性 。
50 90
用标 准 S- 型曲线 定义 IL-2 活力单 位 ，意 义明 确， 澄 清了很 多模 糊概 念 。表 S-3 中 3 条
S- 型曲线参 数表 示的 样品 性能及 其相 互关 系表 明， （i ） 决 定样 品性 能 与 活力大小 的是 k 。 RDE
与 k 直 接相 关 ， 两 者成 正 比， 与 b 无关 ， 表示 的样 品性能 意义 明确 。 （ii ）ED 或 ED 是两
50 90
个特殊 剂量 值， 是获 得 50% 或 90% 效能 选择 使用 剂 量的依 据， 但 不 体现 样品 性能， 如 y 和
1
y 两个样 品 ED 相 同， 但活 力不同 ， 一个 高于 标准 值 ， 一 个低 于标 准值 ， 所以 不能 用 ED
50 50
2
标定 活 力大 小 。 （iii ）IL-2 活力是 剂量 效应 的表 现形 式， 效应 是剂 量的 函数 ， 不同剂 量产 生
不同的 效应 ， 标 定活 力大 小一定 要有 剂量 （浓 度 ng/ml ） 的限定。 用一个 活 力 单位 （U ） ，或
多少 U/ml ，多少 U/ng 表 示活力 大小 都不 对。 （iv ）样品性 能是 在特 定环 境条 件下获 得的 ，
没有适 宜的 环境 条件 性能 表现出 来。 所以 商品 说明 书 不仅 要 提 供性 能参 数 ， 还应该 提供 适 用
环境条件，比 如（ 1） 生产 厂 商， 生 产日 期， 产品 编号， （2 ） 产品 性能 参数 ： k ， ED ， ED ， RDE ，
50 90
活力单 位大 小， 适用 环境 条件 。 只有 剂量 效应 曲线 图 ，没 有 S- 曲线 方程 ， 没 有意义 。
市场销 售 的 IL-2 商品使 用 说明， 既不 规范 ，也 不正 确 。有 的只 有活 力大 小 ， 多少 IU ，
没有其 他信 息。 有的 虽然 提供了 一些 性能 指标 ， 也是 概念 错误 ， 表 述不 正确 ， 没有 意义 。 如
下面一个 商品 的 规格 说明 ， 效能与 活力 ， EC 与 浓度 与 比活度 ， 概念 混淆 不清 ， 表 示不正 确 。
50
给出一个 性能 曲线 图 ， 没 有 曲线 方程 ， 解析 不出 性 能参数 。 给 出了 稀释 方法 和浓度 ， 没有 使
用环境 条件 ，对 临床 应用 没有意 义 。
6
品名：HIL2-RO (hIL-2) ， 效 能>2 x 10 units/mg EC Concentration
50,
10-20U/ml 。质量水平 100. pkg of 10,000 U (10799068001 [5 μg, 50 ml]). 比活
6
度/ EC50 >2 x 10 U/mg <0.5 ng/ml （hIL-2 ，NIBSC ，1st 国际 标准，86/504），
推荐的稀释方法： 用 PBS 或含 有 1mg/ml BSA 或 HSA （0.1 ％ ） 或 1 至 10 ％血
清的培养基稀释浓缩的 IL-2 溶 液（200U/ml 或 10,000U/ml）。
1.4 检测 IL-2 促 细胞增殖 活力 的意义
IL-2 是由活化的辅 助 性 T 细胞分 泌的 一种 细胞 因子 ， 是调 节细 胞免 疫反 应的 重要活 性
物质。IL-2 生理活性检 验 应该为 疾病 的诊 断和 治疗 提供帮 助 。 但是 IL-2 促细胞增殖 活力 检
验 存在 太多 问题 。
（1） 检验 方法 不反 映真 实 的 IL-2 性能， （i ） 用标 记 方法检 测靶 细胞 变化 ，核 素和染 料
并没有 真正 或全 部进入 细胞 内， 至少 部分 是吸 附在 细胞表 面， 活细 胞与 死伤 细胞都 可以 吸附
标记物 ，所 以实 验结 果不 是 IL-2 活力的真实 表现 ， （ii ）EC 不决 定活 力大 小，EC 大 ，活
50 50
力不一 定高 ；EC 小， 活力 也 不一定 低 。 用EC 标定的 活力 单位 没 有意 义。 因此 传统 方法 检
50 50
测 的 IL-2 促细胞增殖 活力 ，既不 准确 也不 真实 。
（2） 促 细胞 增殖 活力 不是 IL-2 特有的属性。（ i ） 用 CTLL-2 细胞做指 示细 胞，CTLL-2
是经过 驯化 对 IL-2 依赖性 生长的 细胞 ， 不 是正 常的 免疫细 胞， 检测 结果 不代 表正常 免疫 细
胞的增 殖活 力。 （ii ） 调 节 细胞免 疫反 应能 力是 IL_2 特有 的属性 ， 促 细胞 增 殖并不 是 IL-2
特有的 属性，很多营 养成分，氨 基酸，多肽， 糖脂都能促 进细胞生长增 殖。 所以检 测 IL-2
促 细胞 增殖 活力 意义 不大 。
IL-2 促细胞增殖 活力 检验 方法， 实验 结果 ， 既 不准 确 也不真 实， 对 疾 病的 诊断 和治疗 没
有帮助 ，做 这样 的检 验没 有意义 。
7

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2.IL-2 提高细胞免疫 杀伤 活力检验方法
提高细 胞免 疫杀 伤反 应能 力是 IL-2 特有的 属性 。细 胞免疫 反应 能力 主要 指细 胞免疫 杀
伤 活力 ，即 细胞 毒 性 （Cytotoxic activity CA ） 活 力。 实验方 法与 促细 胞增 殖检 验方法 类似 ，
原理与 实验 条件 有所 不同 。
2.1 原理
用癌细 胞做 靶细 胞， 如 K562 ， A549 ， 用 免疫 细胞 做效 应细胞 ， 用 IL-2 作用于效 应细胞 ，
提高 效 应细 胞 杀 伤活 性 间 接作用 于靶 细胞 。 效 应细 胞作用 于靶 细胞 使之 损伤 和死亡 ， 靶 细胞
死伤率 转换 成 杀 伤率(Killing Rate, KR) 用作效应 指标。KA 是 IL-2 剂量（D ） 的 函数， 两者
i
同样表 现 为 S- 曲线。 解析 S- 曲线获得 IL-2 调节细胞 免疫反 应 能 力的 实验 参数 。IL-2 对靶细
胞没有 杀伤 作用 ， 通过 效 应细胞 杀伤 靶细 胞发 挥效 能。 实验 方法 需要 将 KA 与 IL-2 剂量D 之
i
间的间 接关 系变 成直 接关 系 ， 办 法是 将效 应细 胞剂 量 （密 度） 固定， 剂量 一定 作用效 能也 一
定。 实验 体系 的靶 细胞 与 效应细 胞都 是选 定的 指示 细胞 ， 固定 剂 量不 变， 只 有 IL-2 是变量 。
于是靶 细胞 的变 化 与 IL-2 剂量变 化直 接联 系起 来， 构成剂 量效 应关 系。
同样条 件下 ， 效 应细 胞密 度不同 杀伤 活性 不同 ， 如 何选择 和确 定效 应细 胞密 度 呢？ 方法
是先做 细胞 毒检 验 ， 即 固 定 IL-2 剂量， 以 效应 细胞 密度为 变量 ， 检测 KA ， 然 后解析 剂量 效
应曲线 ，用ED 作 IL-2 活力检 验的效 应细 胞密 度。 细胞 毒检验 方法 有 专 题介 绍 。
50
2.2 实验方法
遵循 LDCFA 原 理， 用癌 细胞 株 K562 或 A549 做靶 细胞， 用外 周血 淋巴 细胞 做 效应 细
胞 ，IL-2 为效应因子 ， 与 无血清 培养 基共 同构成 实验 体系 ， 做克 隆培 养 。 一 个克隆 单位 里平
均一个 靶细 胞， 加入 以EC 限定的 效 应细 胞密 度 和 不同 剂量（ 浓度 ）的 IL-2， 每个 IL-2 剂
50
量组 有 n （50 左右 ） 克隆 单位 。 以细 胞克 隆为 标志 ，用阴 性单 位数 （r ）计量 靶细胞 变化 。
0
将 n 和r 转换 成 存 活的 靶细 胞均数 （μ ） ，再 用 μ 计算 杀伤率 。
0
r
0
μ= ? ln P(0) = ?ln ，
n
效/ 靶细 胞在 克隆 单位 里随 机发生 反应 ， 克隆 单位 内 存活的 靶细 胞均 数 ? 决定于 Poisson
分布和 细胞 毒作 用两 方面 因素。 各实 验组 加入 的靶 细胞和 效应 细胞 都一 样， 细胞毒 活力 随着
IL-2 剂量增加而 增强 。 对 照实验 组没 有 IL-2， 细胞 毒活力 可能 为 0 ， 检测 出来 的 ? 与加 入的
i
? 相同 ；如 果有 细胞 毒作 用， ? 会随着 IL-2 剂量增加而 减少 。 用 ? 表示 对照组 均数 ， ?
0 i 0 i
表示实 验组 均数 ，
? ? ? ?
0 i i
KA ＝ = (1 ? ) （% ）
? ?
0 0
细胞毒 效 应 KA 与 IL-2 剂量（D ）之间 的关 系表 现 为 S- 曲线。KA 用 y 表示 ，D 用 表
i i
示， 将实 验值 代入 S- 曲线公式 （S-1） 的 线性 方程 （S-2） ， 做回归 计算 获得 样品 性能的 参 数 。
1
= ..... (S-1)
?????
+
?1 ?1
ln(y ? a) = lnb? k = ? ???? ln(y ? a) = lnb? k = ? ???? ..... (S-2)
2.3 IL-2 提高细 胞免疫 活力 表述方 法
IL-2 提高细胞免 疫活 力表 述方法 与 IL-2 促细胞增 殖 活力相 同。IL-2 提 高细 胞 免疫活 力
与活力 单位 的定 义 ， 同样 以标 准 S-型 曲线 为依 据，
8




活力单 位定 义为， 在标准实验条件下，1ng/mlIL-2 样品产生 1%效应值 （1%KA ） 的活力
为1IU。
IL-2 样品活 力大 小 ， 根据 样品 测出 的 S- 型曲 线计 算 RDE ， 样品 活力 大小 为 1.084XRDE 。


















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