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[原]慢病毒载体的设计 以HIV-1为骨架，将其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞（如293T细胞）进行包装。与三质粒系统相比，第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上，新增一个质粒更增加了系统的安全性。第二个变化是将tat基因去除，并在载体质粒上增添了与异源启动... 阅127 转1 评0 公众公开 21-11-15 09:55 |
最后包装成慢病毒，将重组载体和3个用于病毒包装的辅助质粒共转染至293T细胞中，转染后通过观察荧光确认转染效率，超速离心收集慢病毒所在的上清液并过滤，接着用PEG-NaCl浓缩，通过蔗糖垫纯化慢病毒，最后进行滴度测定和无菌检测等。由于质粒法转染获得细胞的拷贝数往往是不均一的，会出现部分细胞拷贝数高，部分细胞拷贝数低甚至没有，这就造... 阅3958 转15 评0 公众公开 21-11-04 09:26 |
[原]表达载体构建的详细步骤 为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 阅476 转1 评0 公众公开 21-10-27 10:58 |
[原]质粒构建原理及流程 质粒构建原理及流程。外源 DNA 经 PCR 扩增后，用限制性内切酶分别切割载体和外源 DNA 片段，DNA 连接酶将二者进行连接，然后转入宿主细菌，通过筛选鉴定获得重组克隆。经过一系列的操作，「快递员」质粒就完成了呈递目标片段的工作。质粒构建流程示意图。质粒构建的步骤。「快递」目标片段的过程主要有三个步骤： 阅426 转2 评0 公众公开 21-10-21 09:28 |
[原]慢病毒载体潜在的不利因素 慢病毒载体潜在的不利因素。慢病毒载体的主要不良反应实际上是所有逆转录病毒载体的共病，因为它们都是利用逆转录病毒的生存周期，将病毒基因组整合到宿主细胞基因组。虽然在亲嗜性逆转录病毒或者双嗜性逆转录病毒包膜感染的具有分裂功能的逆转录病毒整合细胞系中已经检测到了具有复制能力的逆转录病毒，但是目前并没有关于慢病毒载体细胞中出... 阅291 转1 评0 公众公开 21-10-09 11:28 |
[原]慢病毒载体的详细介绍 LV是目前最实用的基因载体，也是基因治疗应用中重要的研究工具，因为其可以感染细胞并使携带的基因整合到基因组上长期稳定的表达。虽然用于治疗目的的LV或慢病毒转导细胞的使用产生了一些重要的问题包括质量、疗效、安全性、伦理、社会和监管问题，但是本次探讨的范围是限于LV在研究活动的生物风险评估。本文主要阐述与宿主系统有关的载体选择... 阅195 转1 评0 公众公开 21-10-09 11:28 |
一些常用的质粒类型包括：克隆质粒、表达质粒、基因下调质粒、基因敲除质粒、报告质粒、病毒质粒等。表达质粒：利用乳糖操纵子等结构过表达目的基因基因下调质粒：利用基因沉默（抑制mRNA翻译）的原理减少宿主细胞内源基因的表达。基因敲除质粒：质粒中可插入基因敲除所需的元件，如用CRISPR/Cas9敲除时，质粒中含有Cas9蛋白的基因序列并插入一... 阅1419 转2 评0 公众公开 21-10-09 11:13 |
[原]实验室怎样构建质粒？ 实验室怎样构建质粒？由于实验室质粒的人造特性，它们也被称为“vectors”（载体）或“constructs”。克隆方法的选择取决于所用的质粒骨架，一旦克隆步骤完成，包含新插入基因的载体将被转化到细菌细胞中并且将转化菌液涂在含有抗生素的板子上进行选择。质粒构建简化过程：提取质粒，扩增目的基因片段——对质粒和目的片段进行酶切处理——连接... 阅134 转2 评0 公众公开 21-10-09 11:12 |
[原]质粒名词解释和概念 直到60年代科学家开始研究其它的染色体外粒子，特别是R因子（Resistance factor，抗药因子或抗多药剂因子）,通过细胞间的接触，F因子和R因子能够在细菌间水平转移，然而科学家注意到，不同于F因子，没有证据能证明R因子可以整合到质粒上，因此，“episome”最终被舍弃，而采用“plasmid”来命名这些胞外遗传因子。F因子（致育因子）：供体菌细... 阅1025 转2 评0 公众公开 21-10-09 11:10 |
过表达载体构建流程及注意事项。2. 查找CDS区序列的酶切位点，对比载体上的酶切位点，避免冲突（可使用primer premier5 软件或南京德泰生物镜像（网站））；表达载体构建简要流程1. PCR扩增出基因CDS区，1400bp左右，胶回收；2. 双酶切胶回收产物及载体，胶回收；引物设计：CDS区序列，5’端依次加上标签序列、酶切位点和（或）保护碱基； 阅2865 转7 评0 公众公开 21-10-09 11:06 |
