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DNA显微注射法的基本过程包括转基因载体的准备、胚胎操作和显微注射、转基因动物的鉴定和培育。用DNA胶回收试剂盒从胶上回收DNA片段，测定DNA浓度。BAC DNA显微注射：BAC为环状DNA，可以通过QIAGEN等DNA提取试剂盒分离。由于BAC DNA较大，在注射时产生的剪切力有可能打断DNA，产生的转基因小鼠需要用PCR和Southern blotting等方法鉴定是否含有... 阅2851 转10 评0 公众公开 19-07-10 21:07 |
诱导性基因表达系统。(1)Tet可控基因表达系统：到目前为止，在转基因小鼠中最广泛使用的可控基因表达系统是基于大肠埃希菌四环素(tetracycline, tet)操纵子的tet基因表达调控系统。Tet可控基因表达调控系统分为Tet-Off和 Tet-On(图3-2)。一种是用组织特异性或其他启动子表达的tTA(Tet-Off)或rtTA(Tet-On)转基因小鼠，另一种是表达目的基因的转... 阅7608 转32 评0 公众公开 19-07-10 20:26 |
点特异性重组系统，包括Cre-LoxP系统和 FLP-FRT系统，迄今为止最广泛使用的方法是Cre/ LoxP介导的点特异重组系统。Cre重组酶可以介导两个LoxP元件间的重组反应，每个重复序列可结合一个Cre分子，重组发生在间隔区。如果同一条DNA链上的两个LoxP元件方向相同，Cre酶会介导LoxP间的 DNA序列切除并环化，原序列中只留下一个LoxP元件，另一个LoxP位... 阅582 转9 评0 公众公开 19-07-10 20:26 |
基因修饰动物的表型分析。基因敲除小鼠交配得到纯合子后，观察基因敲除小鼠纯合子是否导致胚胎致死。转基因和基因敲除小鼠的表型分析是非常重要、细致、困难的工作。许多基因修饰动物只有非常细微的变化，需要用各种先进的设备和方法，如分子病理、小动物成像分析、DNA/RNA测序分析和流式细胞分析等，进行大量的实验才能发现有意义的表型变化。 阅513 转2 评0 公众公开 19-07-10 20:20 |
常用的小鼠为C57BL/6和BABL/c，将出生的嵌合小鼠与所需要的遗传学背景小鼠交配产生基因敲除纯合子或杂合子品系：①如果ES细胞是来源于129小鼠，用C57BL/6宿主胚胎产生嵌合小鼠，与C57BL/6小鼠交配产生 C57BL/6×129 F1背景。②如果ES细胞来源于C57BL/6遗传背景，最好选用白化毛色的宿主胚胎，如白化C57BL/6系列(C57BL/6-Tyrc-2J或C57BL/6-A... 阅101 转0 评0 公众公开 19-07-10 20:20 |
基因型鉴定方法。引物的设计很关键，转基因动物基因型分析的引物通常位于转基因内，一般选择特异性的DNA序列作为引物以确定转基因是否存在。对于基因敲除和基因敲入动物，由于明确知道基因修饰的位置，因此，可以设计野生型和突变型的引物以确定基因型是否为纯合子或杂合子。转基因小鼠的基因型鉴定可以只用一对特异性引物进行分析，结果为阳性... 阅6722 转18 评0 公众公开 19-07-10 20:20 |
在针对浸润性导管胰腺癌的研究中，研究者使用条件性基因敲入的方式获得KrasG12D点突变敲入且以LoxP-stop codon控制表达的小鼠，同时以pdxl启动子特异性控制Cre重组酶转基因小鼠的Cre表达，仅在两种小鼠杂交产生的表达Cre重组酶后代中，有胰腺癌变发生。除了Cre/LoxP重组系统外，还有许多相似的重组酶系统，如Flp/Frt重组酶系统，不过由于Flp重... 阅1061 转8 评0 公众公开 19-07-10 20:20 |
全身性基因敲入。在不删除宿主基因组序列的前提下将外源基因定点整合后控制其高效表达，通过人为控制插入位点可以有效避免基因插入内源基因外显子产生突变、干扰其表达的可能性，还可以尽量避免插入位点效应对于外源基因表达产生的基因沉默，让转基因变得更“靠谱”。除了定点插入外源基因外，基因敲入还可以利用同源重组实验特定靶基因的点突... 阅231 转2 评0 公众公开 19-07-10 20:20 |
特别是与发育相关的基因，用传统基因敲除技术从胚胎发育一开始就全部去掉这些基因，会引起胚胎致死，使研究难以进行下去。Rajewsky实验室首先利用Cre- LoxP点特异性重组系统建立了条件基因敲除技术，这一技术很快得到广泛的推广和应用。利用LoxP位点制作的条件性敲除小鼠(图3-10)通过和全身性表达Cre重组酶的转基因或基因敲入Cre小鼠，如EIIa-C... 阅2957 转8 评0 公众公开 19-07-10 20:18 |
精子介导的基因转移法。精子介导的基因转移法(sperm-mediated gene transfer,SMGT)是将成熟的精子与外源DNA进行预培养之后，使精子结合外源DNA，通过体外受精、胞质内单精子注射法或输精管注射法，吸收有外源DNA的精子进入卵子中，并使外源DNA整合于染色体中。1991年，Horan用猪的精子进行的实验表明，DNA与精子牢固结合，每个精子约结合3.8&#... 阅1074 转7 评0 公众公开 19-07-10 20:18 |
