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显微摄影是通过显微镜进行拍照的一种技术方法。
显微镜下的蚕豆叶表皮
显微镜是一种观察微观事物的重要光学仪器。利用它的高倍放大作用可以观察到肉眼直接看不到的信息。显微摄影又可以把显微镜观察到的现象记录下来，供人们更广泛的研究。
显微镜分为光学显微镜和非光学显微镜两类。（非光学显微镜有电子显微镜、超声波显微镜等）
普通光学显微摄影装置就是将普通相机与显微镜组合在一起，利用相机记录本来由人眼观察的显微图像。
光学显微摄影机械装置的调整
机械装置的调整对做好显微摄影工作也很重要，特别是抽筒的长度要确切，否则倍率不准， 如用油镜头拍摄时抽筒要拉至170毫米处，拍摄不透明标本，要根据其厚度将抽筒拉出在190 ～250毫米范围内。对标本和盖片玻璃的厚度也有严格要求。
调焦时要注意先扭旋大螺旋于标本近处，然后自下而上移动，初步调清后，再微调小螺旋， 直至最清晰。切不可自上向下对焦或是直接用大螺旋调焦。
移动聚光器时要依据亮度的需要。无论拍低位或高位，都要首先用低倍的接物镜对焦、对光 。对光时把聚光器升到最高点，然后调整反光镜或光源光束，使最亮部分处于视野中心并使 其亮度均匀，再转换所需要的高倍镜。调好焦点后，将聚光器下降至焦点与景深合适时为止 。在使用油物镜时，要将集光器升至最高，与载片吻接，并点油使其与标本、物镜构成一个 光具组。
显微摄影中还要注意光学与机械装置的配合，否则不是光线不均匀就是倍率不准确或是分辨 率不强。所以，必须要求：
- 显微摄影装置必须放置平稳，组合照相装置、显微镜、光具组时要注意光路合轴。
- 将标本切片放在载物台上，用低倍调焦后作光束合轴调整。调整时先把虹彩光阑、光 源光阑开到最大，集光器调至最高，在目镜上检视成像情况。如果太亮，可用深色滤色镜减弱强光。
- 将物镜调至所需要的倍率，收缩光源光阑和集光器光阑。集光器下降至适当位置，集 光器高时，视场明亮、景深短；集光器低时，视场暗、景深长。由于在显微摄影中，景深长 有可能将玻璃片或聚光器上的脏东西也呈现在画面上，所以长的景深也不宜采用。
- 成像面必须平行于标本平面，否则倍率不准、影像也会变形。
光学显微摄影的用光
光学显微摄影必须要有明亮、均匀、无反光的照明，同时要注意光源的调节和色温的变化。 另外，由于样品的性能差异，还要选用不同的照明方法。下面我们从两方面介绍一下光学显 微摄影的用光。
（1）光源
光学显微摄影的照明，会对物镜解像力产生明显影响，一般要求光源的输出能够集中到 很小面积上，光强高、热量小，几何尺寸不大。
在一般明视场照明显微摄影时，通常采用6伏或者12伏螺口形白炽钨丝灯泡做照明光源，色温为2700～3200K，其亮度的调整由变压器实现，这种照明尽管看上去很亮，色温并不高，所以，应尽量用最高电压，使灯光亮度、色温提高，并使用RAW格式拍摄，以便后期校正色温。
但是，白炽钨丝灯泡长期使用，其钨丝蒸发后所产生的沉物会积聚在玻璃罩内壁，这样会降低亮度与色温。所以，12伏100瓦的卤素钨丝灯光便成了光学显微摄影的优质光源。（这种卤素钨丝灯在灯管内充卤素气体，在灯丝点燃后，蒸发出来的钨会与卤素气体形成卤化钨，附着在灯管内壁，而关闭电源冷却时，卤化钨又会分解，届时钨又回到灯丝上去，这样便延长了灯泡的使用寿命 ，改善了光源照明，缩小了灯泡的几何尺寸，提高了光源强度）。
用于光学显微摄影的光源还有氙灯、锆灯、电子闪光灯、汞蒸气灯等，可以根据不同的目的，选用适当的光源。如氙灯不仅可以发出连续的可见光，还包含长波紫外线和红外光谱部分；汞蒸气是优质的单色光源，特别适于单色黑白显微摄影。
（2）光学显微摄影的用光方法
拍摄显微照片，要求有明亮、均匀、无反光的照明条件，其照明方法可分为两类，即透射照明和反射照明（落射光照明）
透射照明
反射照明
透射光照明是指从光源射出的光线从标本的下面透过标本进入物镜。而落射照明是指光线从正面投射到标本的正面，物镜接受的光是从标本反射来的光。
透射光照明通常按照克列尔（Kohler）照明法调节光路便可以获得优质效果。
使用时调节光源光阑和距离使照明光束投射到反光镜中央。关闭聚光镜光阑，移动光源透镜 ，使灯丝清晰地在聚光镜的孔径光阑平面成像。先将样品聚焦，随后从载物台上除去标本， 通过目镜对焦，上下移动对焦器，直到标本平面上出现光源光阑的像。聚光器光阑通常收缩 至0.6～0.7厘米（直径），与光源光阑配合，除去光斑得到鲜明的像。在高倍显微摄影时， 要一面收缩聚光器光阑，一面观察，使出现的灯丝像达到最大，大约使光源距离距显微镜达 40-50cm为好。
落射光照明主要用于拍摄不透明的标本，如皮肤、小生物、植物果实表面等。拍出的像有立体感。落射光与物镜之间的角度越小越好，现代显微摄影装置的落射光大多与物镜合轴。 在没有专业设备的情况下可以用斜射照明，在对应面加反光屏，或用另一只灯做辅助光，也可以使用环形闪光灯。
光学显微摄影中滤色镜的应用
滤色片几乎在拍摄什么样的标本都有用场。例如：
- 用滤色片校正反差突出重点光学显微摄影往往要突出重点，这就要使用适当的滤色镜加强反差，强调需要突出的重点结 构 ，而减弱其非重点部分。使用标本染色补色的滤色镜可以增强标本反差，比如苏木精染出的 色标本中用绿滤色镜，就可增强反差。
- 两种颜色的结构体现： 如果想使标本中两种以上的颜色都清楚地呈现在画面上，如红、蓝两种颜色，可以采取两次 曝光的方法，先用红滤色镜，再用蓝滤色镜各曝一次光，就可以清楚地体现两种颜色的结构 。
- 短波光滤色镜可以提高对标本的分辨率。 短波光滤色镜（如UV镜）可以分辨出在可见光下肉眼看不见的组织结构。用紫外线滤色片配合紫外胶片可提高成像可分辨，达到560～1000线/毫米。 紫外线光源的射线很热，采用一般滤色片容易烤焦标本，所以要用液体滤光器，其 内装有氯化铜或硫酸铜溶液30克/升。这不仅可以防热、吸收红外线尚可让紫外线通过。
光学显微摄影的曝光控制
虽然现在的相机均有自动测光或自动曝光功能，但是如果一个视野中亮处面积超过二分之一，则易出现曝光不足的现象，所以如果标本主体小，又处在亮背景中，就要适当增加曝光时间。
在控制曝光时，要注意以下因素：
- 光源强度的影响： 由于电压的变化，光源亮度可能产生5-10倍的变化。
- 光源的距离及对标本的照射面积。
- 光源的波长及色温。 光源的波长长、色温低，色光偏红时，曝光时间要长些。光波短，色温高，色光偏青时，曝光时间要短些。
- 电压的波动会引起曝光量的改变，所以摄制过程中要保持电压的相对稳定。
- 聚光器的位置经过实验固定后不宜改动。
- 使用滤色镜、乳白玻璃、偏振镜等都要按其曝光指数增加曝光时间（手动曝光）。
- 目镜的放大倍率。 以×5倍的目镜作曝光基准1时，×10倍目镜要4倍的曝光量，×15倍目镜要增至9倍的曝光。
- 物镜的倍率和N·A值： 如果把×10倍的目镜作为1时，×40倍目镜要2.5倍的曝光，×100倍的物镜要4倍的曝光。
- 从目镜出射点到感光片的距离
- 标本的染色也会对曝光产生影响
- 标本与目镜间的介质折射率大、曝光时间短，反之，曝光时间长。曝光时间与折射率成反比。
- 聚光镜的光阑孔径变化能使曝光产生2～20倍的变化。
光学显微摄影的反差控制
光学显微摄影的反差强一些为好，影响反差的因素有以下五个方面：
- 标本本身对反差的影响
- 标本切片厚会产生光的折反射，同时细部结构产生重叠。
- 标本新鲜、色彩鲜艳反差强。
- 标本载物片厚或盖片厚、有色、有水纹都会降低反差。
- 照明对反差的影响： 照明应适中，否则会降低反差，太亮会冲击标本细部结构，太暗会使光路中的脏物呈现在影屏上。
- 光束直径与视场直径一致时反差强，光束直径大于视场直径就会降低反差。
- 集光器与虹彩对反差的影响： 集光器过低、虹彩与光栏小，都会降低反差，所以要依具体情况升降集光器或开放虹彩。虹彩光阑的直径必须与物镜口径一致。
- 滤色片对反差的影响： 用补色滤色片反差强，用统一色滤色片反差弱。
光学显微摄影的反差虽然是大些为好，但也要适当处理，不然反差过大就会损失细部结构， 同时也会影响分辨率，同样不能得到完美的效果。
附：光学显微镜的构造、成像和性能
现代光学显微镜，基于不同用途、种类繁多，如有生物显微镜、金相显微镜，解剖显微镜 等，但基本结构仍为光学和机械两个部分。
单式光学显微镜（通常用的放大镜、解剖镜等）光学结构简单、放大倍数小、光行差明显， 不宜进行显微摄影，在这里就不作介绍了。
复式显微镜光学系统比较完善、机械装置比较复杂，适合于显微工作的开展：
1.显微镜的成像
显微镜的成象光路：
它通过目镜、物镜等光学器件构成放大光路，而使所得虚像A“B”的距离恰好等于人眼的鸣视距离——250毫米，以获得将标本放大10～200倍的可见影像。
2.光学显微镜的基本结构
光学显微镜的基本构造分为两部分。一部分是光学系统，如接目镜、接物镜、聚光器、光源等，另一部分是机械系统，如镜脚、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、大小螺旋、推进器等。
（1）接物镜
接物镜是光学显微镜的关键部件，整个显微镜系统的成像质量与分辨率都由接物镜决定。它 由一组精密的透镜组成，其作用是将检视标本做第一次放大。显微接物镜生产时做过各种像 差校正，它有一个光阑——孔径光阑，可以控制入射光束的直径，其作用是减小或扩大视场 而不改变像的明亮度。
接物镜有不同倍率其中干燥系用在正常情况下观察。水浸系或油浸系在观察时要 在接物镜口与标本结合处点水或点油。
由于接物镜的成像质量影响摄影效果和观察效果，所以接物镜也是显微摄影的重要组成部分 。
接物镜有三个主要参数——数值孔径N·A值、放大率和盖片厚度。它们都标在镜头 壳上。
①N·A值
数值孔径N·A是标志物镜工作性能的重要参数，它决定了物镜的分辨率。N·A=n·sinθ (如下图) 式中n为介质折射系数，Q为入射角。
上图中，表明了物镜数值孔径与介质折射系数、入射角的关系。理论上的最大入射角为180°， 它的一半（90°）的正弦等于1，而空气的折射系数为1.0，水的折射系数为1.33，松节油的折射系数为1.5，所以在同样入射角情况下液浸物镜数值孔径比干燥物镜的大，因此分辨能力也大得多。
N·A值越大，分辨率越大，N·A值越小，景深与焦深越长。
N·A值尚与镜口角有关，镜口角越大，进光量越大，所视像野中的影像越清楚，分辨率就越 大。反之，分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物镜的镜口角小于高倍物镜的镜口角， 所以低倍物镜的分辨率就不如高倍物镜的分辨率大。（这是指干燥系而言，油浸系物镜有介 质的折射率，可提高分辨率（见下图）。
分辨率还受照明强度及光源波长的影响，在一定范围内，照明强度大，分辨力就大。
②放大率
放大率是指检视的放大倍率（即虚像放大倍率），倍率越大，工作距离越近。对每个具体物 镜来讲，它的放大倍率是不变的，工作距离也是不变的。如果采用10×目镜、40×物镜，观 察时放大了400倍，但对显微摄影来讲，由于要增加目镜到 感光片的这段距离就不是400倍了，有些显微摄影的摄影倍率是显微镜放大倍率的1/2。(见显微摄影装置示意图)
③对盖片厚度的要求
显微镜对盖片的厚度要求为抽筒的1/100,达0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒则必须相 应改动10毫米，否则其放大倍率就不是标示的倍率了。
油浸镜（见下图）是借点油的折射率来提高视野的亮度和分辨率。点油后使接物镜 与标本构成一个光具组。
常用于油浸镜的点油及折射率为：
洋杉木油1.51
檀香木油1.51
甘油1.46
树胶1.52
苏合香1.58
折射率越大呈像亮度越强，分辨率也就越大。
（2）接目镜
接目镜主要有以下两个作用一是将物镜送来的初级放大影像再作第二次放大。
二是矫正接物镜成像中的相差、色差和照度。 接目镜的放大率一般从×4～×25，其镜筒长的放大倍率大，反之，放大倍率则小（见下图）。
眼点是目镜的一个主要参数，在显微摄影中为尤重要。眼点即显微镜对清焦点后在目镜上形 成的出射点。一般眼点距离目镜0.5厘米左右，放大倍率越大，这段距离越短，放大倍率越 小，这段距离越长。目视时，瞳孔恰与此点相接，用带镜 头的照相机摄影时，镜头的前片透镜表面要与此点相接，用不带镜头的摄影装置拍摄时，要 从眼点计算所加近摄装置（伸缩皮腔形式或近摄接圈）的伸长尺寸，以计算实际倍率。
（3）聚光器
显微镜的聚光器有明视野聚光器、暗视野聚光器和特殊用途聚光器（如偏振光、相位差等等 ）。
①明视野聚光器
明视野聚光器由集光器、虹彩、滤色镜环和反射镜四个部分组成（见下图）。
其中集光镜由两个或两个以上透镜组成，象一个简单的照相机镜头，它的数值孔径（N·A) 值为1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物镜对标本的分辨率。
②虹彩
结构像照相机的光圈，它不但可以调节照明强度，同时还具有改变分辨率和反差的作用，即 ：虹彩开大，分辨力高，反差弱，虹彩缩小则相反。滤色镜环用来放置滤色片或毛玻璃，可 用来改变光色或亮度。
反光镜分为平凹两面，并要使光束正好对准反光镜中央。
③暗视野聚光器的视野背景是暗的，被摄体是发光的或明亮的。其结构见下图：
暗视野聚光器通常用于拍摄极微小的物体，如化学明胶、梅毒螺旋体或明视野看不见、看不 清没有染色的标本。它也常常用于荧光显微摄影。 使用暗视野聚光器拍摄时光源亮度要强些，不能使用滤色镜。为防止外来光线干扰，暗视野 显微摄影最好在暗室中进行。
3.光学显微镜的主要性能
光学显微镜的主要性能从两方面体现，即放大倍率和分辨率。
（1）放大倍率
理论上讲，光学显微镜的放大倍率在镜筒长度为16～17厘米时为物镜×目镜倍率，但是我们 要 将实物看清，不仅仅是要将其放大，更主要的是分辨出它的细部形态，所以放大倍率要与物 镜、分辨率同时考虑。如，同样是放大200倍的显微镜目镜与物镜，可以有三种组合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三种组合形式的分辨率、焦点深度与成像面的亮度、拍摄时需 要使用的快门速度有很大差别(见表8-6)。
| 物镜 |
（1） 20×10 |
（2） 41×5 |
（3） 10×20 |
| 物镜的数值孔经 分辨能力 焦点深度 焦平面亮度比 照相快门速度 |
0.40 0.70µ 1.25µ 1.0 1/30秒 |
0.65 0.43µ 0.77µ 0.8 1/200秒 |
0.25 1.1µ 2.0µ 0.4 1/40秒 |
在显微摄影中，其放大倍率与出射点至感光片的距离有关，所以显微摄影的放大 倍率的计算公式为M=物镜倍率×目镜倍率×目镜出射点至底片的距离/250毫米。这个公式说 明，只有当目镜出射 点至感光片的距离为250毫米时，显微摄影的放大倍率才等于物镜倍率×目镜倍率，若将目 镜 出射点到感光片的距离加大，其放大倍率也随着加大，但这只是形态增大而分辨率不变。将 底片用来放大照片时也只是形态的放大，而不增加分辨率。
本文根据南开大学《摄影基础》教材删改而成。
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