作为最有前途的抗生素替代品，绿色微生物制剂乳酸菌在水产动物中的研究却刚起步，特别是其对水产养殖环境的影响以及抗菌机理的基础研究还很少，将其潜能变成现实尚有一段距离
□文/湛江恒兴南方海洋科技有限公司 王昊 李色东 中国水产科学研究院南海水产研究所李纯厚李卓佳
乳酸菌(Lactic acid bacterium，LAB)是一群能从可发酵性碳水化合物中产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的通称。乳酸杆菌有44个种，连同亚种共51个种，是革兰氏阳性、无芽孢、细长、有弯曲的杆菌。有9个属：其中5个属呈球状，如乳酸球菌(1actococcus)、链球菌(streptococcus)等；4个属呈杆状，如乳酸杆菌(1actobacillus)、双歧杆菌(bifidobactrium)等。
乳酸菌是被人类作为食品微生物利用的一大类菌，尤其在增强牛奶保健功能、提高青贮品质、提高畜禽生产性能、降低畜产品贮藏对肉品风味的影响等方面已取得较好效果，广泛应用于食品、医药、轻工业和畜牧业等领域。目前在水产上对乳酸菌的报道主要集中于乳酸菌在水产动物肠胃和其他内脏器官中的栖息情况。乳酸菌在水产上的应用较多，主要是拌入饲料一起投喂给养殖动物，或做为EM菌的主导菌在水体泼洒。
1、生理功能及代谢产物
1.1 乳酸菌的生理功能
乳酸菌在动物体内能发挥许多生理功能。大量研究资料表明，乳酸菌能调节动物胃肠道正常菌群、维持微生态平衡，从而改善胃肠道功能；提高食物消化率和生物效价；降低血清胆固醇，控制内毒素；抑制肠道内腐败菌生长；提高机体免疫力等。乳酸菌通过发酵产生的有机酸、特殊酶系、细菌表面成分等物质具有一定生理功能，可刺激组织发育，对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和应激反应等产生作用。
1.2 乳酸菌的代谢产物
乳酸菌最终代谢产物除乳酸、乙酸外，还能代谢产生其他形式的有机酸、细菌素、过氧化氢、乙醇和罗伊氏素等多种抑菌物质。这些代谢产物不仅能抑制致病菌的生长，对其近缘相关的种或菌株也有生长抑制作用。乳酸菌产生的乳酸现已证明无论是在体内还是在体外都可以对大肠杆菌等革兰氏阴性菌产生抑制作用。尽管乳酸抑制革兰氏阴性菌的作用机理目前尚无明确结论，但其中的一个原因是乳酸菌发酵的代谢终产物之一是乳酸，乳酸的积累导致周围环境pH值下降，降低氧化还原点位，可对许多革兰氏阳性或阴性细菌产生广泛的抑制作用。有研究证明，双歧杆菌在发酵过程中产生的未解离的乳酸是对潜在肠道致病菌和腐败菌拮抗作用的主要成分。乳酸菌产生的细菌素是一大类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，除对近缘相关的菌株具有抑制效果外，某些细菌素如Nisin具有广谱性的抑菌能力。1933年Whitehead H R等从乳酸菌分离出一类细菌素，在1947年将其命名为尼生素(Nisin)。1953年，尼生素首先在英国上市，随后在48个国家开始利用尼生素，1988年尼生素通过美国FDA批准作为食品添加剂。乳酸菌产生的过氧化氢能够激活牛乳中的过氧化氢酶—硫氰酸系统，抑制和杀灭革兰氏阴性菌、过氧化氢酶阳性细菌如假单孢菌属、大肠杆菌类和沙门氏菌属等。
Hemandez等将奶酪中分离到的植物乳杆菌进行抑菌研究，发现对许多革兰氏阳性菌有抑制作用，并确定抑菌物质是细菌素类物质，并且该物质在pH值1-9内都具有很好的抑菌活性。Vizoso等发现从人粪便和发酵产品上分离到的两株乳酸菌具有体外抑菌活性，并认为是乳酸菌产生的有机酸在起作用。Shahani等认为乳酸杆菌产生的复合物可以抑制其它微生物的生长，细菌素是最主要的，但过氧化氢、乳酸也有一定的作用。Stoffels等发现肉食杆菌生长的肉食素对其他乳酸菌的抑制作用非常明显。
2、对水产养殖环境的适应性
2.1 乳酸菌在水产动物体内的定植状况
乳酸菌作为鱼类益生菌，在肠道内具有较好的定植能力，而且在水产动物中，这种定植无明显的宿主特异性。Ringoe应用从大西洋鲑分离的广布肉杆菌，研究在大菱鲆幼鱼肠道内的定植时，证明了这一点。王福强等研究表明，来源不同的鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌均可在牙鲆消化道定植，乳酸杆菌定植和对弧菌产生抑制作用的主要部位在小肠。Joborn 等用肉杆菌来研究其在虹鳟肠道内的定植和对鱼类病原菌的抑制作用，结果表明肉杆菌可以在虹鳟肠道内大量增殖并定植下来，但定植效果不佳，停喂肉杆菌3d后广布肉杆菌的数量明显下降。Rengpipat等用Bacillus 11养殖斑节对虾也得到类似的结果，抑制了水中弧菌数量的增长。陈营研究表明，通过在饲料中添加由单一鼠李糖乳杆菌P15制备的微生态制剂，证明鼠李糖乳杆菌P15可以在牙鲆仔稚鱼肠道中定植，并能控制肠道中的弧菌数量。
2.2 水产养殖环境对乳酸菌的影响
一般水产养殖在养成期间环境的温度、盐度和pH值的变动范围分别为20-35℃和0-38、6.9-8.7。有研究表明，通过环境因子对菌株生长影响的研究表明，乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对水产养殖环境有很好的适应性。乳酸杆菌生长的最适温度为30-40℃，在溶解氧高或低的条件下都能很好生长，也可在分子氧存在下进行厌氧生活。在池塘养殖水体中，中下层水的溶解氧一般较低，病原菌容易滋生，如在其中投入乳酸杆菌使其成为优势菌，可抑制病原菌的繁殖。乳酸菌的其他菌株对水产养殖环境的适应性的研究鲜有，有待进一步研究。
2.3 水产养殖常用抗菌药物和消毒剂对乳酸菌的影响
利用有益菌来抑制病原菌，预防病害发生现已成为一个新的研究热点，在生产中的应用也日益广泛，但利用药物来预防和治疗疾病仍是最主要的手段。各种有益菌对不同抗菌药物的敏感性不一，同一种细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也常存有差异，因此在应用上要考虑菌对药物的敏感性，以达到最佳的使用效果。
李平兰等就微生态制剂中5种乳酸菌对抗生素的敏感性进行了研究，结果表明长双歧杆菌(B.longum)、外嗜酸乳杆菌(L.acidophitus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、干酪乳杆菌(L.case)和粪肠球菌(E.faecalis)对头孢素类、青霉素类、β-内酰胺酶抑制剂复合物中的某些抗生素均表现了一定的耐药性，而5种乳酸菌对四环素类抗生素和大环内酯类抗生素都敏感。马艳等发现乳酸菌1菌株对盐酸林可霉素、庆大霉素敏感，而对丁胺卡那霉素不敏感，并发现复合益生菌可以改变抗生素对原单株菌的最低抑菌浓度，降低原单株菌对某些抗生素的敏感性。周海平通过乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对氟苯尼考、土霉素、二氧化氯、二溴海因、强力碘的敏感性实验结果显示，这些药物对菌有一定的抑制作用。
3、乳酸菌研究进展及其应用
由于抗生素、激素类药物在水产上的不合理使用，导致农药残留问题对人类健康造成了巨大威胁。水产养殖领域，人们越来越提倡生态养殖技术。美国在FDA(1989)规定的40多种饲用微生物中有近30种是乳酸菌。我国农业部在1994年批准使用的微生物品种有蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、乳链球菌等，其中大部分为乳酸菌。乳酸菌耐酸，在pH为3.0-4.5时仍可生长，能适应胃肠内的酸性条件，饲喂后能在水产动物体内迅速定植，因此无疑是一种理想的微生物制剂。乳酸菌在水产中的应用大致可分为以下几个方面：
3.1 抑制病原菌，抗病害
乳酸菌能有效调整水产动物肠道的菌群平衡，通过营养竞争、附着位点竞争或分泌抗生素、细菌素等毒素杀死或抑制病原微生物，增强抗感染能力，调节机体肠粘膜的免疫活性，提高动物在遭受病害侵袭时的存活率。近年来，一些乳酸菌开始应用于水产养殖业，实践证明应用乳酸菌防治水生动物疾病是可行的。
陈营等从健康牙鲆肠道中分离得到多种乳酸菌，且体外实验表明对弧菌均有抑制作用。周海平为探明乳酸杆菌(Lactobacillus.spp)对水产养殖病害的生物防治功能，采用试管稀释法和平板抑菌圈检测法，探讨了乳酸杆菌代谢产物对沙蚕弧菌(Vibrio nereis)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、漂浮弧菌(Vibrio natriegen)的抑制能力，结果表明：乳酸杆菌对病原弧菌具有良好的抑制作用。Jiravanichpaisal等报道了乳酸杆菌作为有益菌可以用来防止由发光细菌感染造成的斑节对虾的白点病。杨莺莺等研究乳酸杆菌L1对致病弧菌的抑制作用，证明乳酸杆菌及代谢物质对鲨鱼弧菌和溶藻弧菌具有协同抑制作用。杨勇等证明乳酸菌代谢产物对鳗弧菌的生长具有非常显著的抑制作用，该代谢产物对鳗弧菌的抑制效率在90%以上。姜英辉等研究了乳酸链球菌L3-18的培养及其对海洋弧菌的抑制作用。窦晓明就乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究表明，3株乳酸菌（命名为A-1，A-2，A-3）胞外产物对副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)有较强的抑制作用。
3.2 促进生长，提高免疫力
乳酸菌能分泌乳酸，产生多种消化酶，可帮助鱼类消化吸收，促进生长。Byurl等从鲆鱼分离并筛选出一菌株Lactobacillus sp.DS-12，它表现出强的抗菌活性，能抑制多种鱼体病原菌（如鳗弧菌、嗜水气单胞菌等）的生长，在2次各为期1个月的饲喂实验中，他们发现饲喂含有DS-12菌株的试验组，鱼的平均体重的增加均比对照组的快，揭示了乳酸菌同时拥有既抑菌又促生长的双重机能。Gildberg等用含有大西洋鳕鱼内脏提取出来的乳酸菌的饲料喂鳕鱼苗，3个月后将鱼苗放养在带有强致病弧菌的环境中，能够提高抗病率。Gatesoupe利用乳酸菌饲养的轮虫作为大菱鲆仔鱼的鲜活饵料，证明乳酸菌可以提高仔鱼对病原弧菌的抵抗力。Nikoskelainent等研究表明，给虹鳟投喂含有乳酸杆菌的饵料，可以提高它们的免疫力。桂远明等报道乳酸菌等微生物制剂对鲤具有促生长和提高抗病力作用。
3.3 净化养殖水体
向养殖水体投放有益菌（光合细菌、乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等）及有益酶（蛋白分解酶、纤维素酶、植酸酶等）的复合制剂，不仅促进饵料生物大量繁殖、生长，而且可分解鱼类残饵、粪便及水中有机质，改良水体环境，抑制水体中有害菌的繁殖生长，调节藻相平衡，控制有害菌藻。使用以乳酸菌为主的微生态制剂，可以有效降低水中的亚硝酸盐含量；而芽孢杆菌对于水体中氨态氮和有机物的分解作用比较明显，可降低水体中氨态氮、亚硝酸盐的含量，避免了传统肥料高耗氧、破坏和污染水质、高发病率的缺点。所以乳酸菌可与芽孢杆菌、光合细菌、反硝化菌等有益菌混合使用，作为养殖水体的水质调控剂，改善水中生态环境，净化水质，促进鱼虾类健康生长。
周海平就乳酸杆菌对养殖水体，饲料的降解作用进行了深入研究，结果表明，各实验组中的NO2--N、NO3--N、PO43-P从实验第1天到第4天一直处于下降趋势，而NH4+-N呈上升趋势，对COD无降解能力，温度、菌浓度、底物浓度对NO2--N、NO3--N、PO43-P、NH4+-N降解率的影响是极其显著的。沈南南研究了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，BL)、光合细菌(PSB)和乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)封闭式高密度养殖水质的调控效果，结果表明，芽孢杆菌结合乳酸杆菌使用，可以明显降低养殖水体氨氮等有害物质的含量。
EM是由多种有益微生物组成的活菌制剂，在水产养殖上既可用作水质净化、改良剂，保持水质稳定，又可作为饵料拌合剂，增强养殖品种的免疫力，促进养殖品种的健康生长，从而提高产量和效益。乳酸菌作为EM菌的主导菌应用于水质净化的效果良好。白维东在成鱼养殖池中使用EM菌，实验池溶氧量比对照池提高11.2%，NH4+-N和NO2--N含量分别降低了54%、55%，饵料系数降低8.2%，单位面积净产量提高14.4%。黄永春报道EM制剂能降低建鲤养殖池氨氮。林新华等研究表明，经复合EM处理后能使养殖水体达到无污染排放。
4 应用前景
从目前的研究报道来看，乳酸菌对动物免疫有多方面的调节作用，能显著提高机体的免疫功能，尤其是在对病原菌的定植拮抗方面，这使对乳酸菌等益生菌研究成为当今生物技术的热门课题之一。
作为最有前途的抗生素替代品，乳酸菌正以其独特的优势影响着医药、食品、畜牧等多种产业的发展。乳酸菌在水产养殖中的应用前景是诱人的，完全有可能取代目前所用的抗生素、化学促生素，成为21世纪人们所接受的绿色微生物制剂。但是关于乳酸菌的研究在陆生动物中开展的较多，而在水产动物中的研究却刚刚起步，特别是乳酸菌对水产养殖环境的影响以及抗菌机理的基础研究还很少。所以要真正把乳酸菌这种潜能变成现实尚有一段距离，仍需要大量的研究投人。由于单一使用某一微生物都存在一些缺点，现在许多学者和生产厂家在试图利用不同菌株的不同特性，将多种微生物培育后复合为复合微生态制剂，以期发挥它们的综合作用。随着对其作用机制研究的不断深入，以及人们对绿色环保意识的不断增强，乳酸菌的应用前景会更加广阔。
参考文献（略）
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