第六章 微生物的新陈代谢
新陈代谢是生物最基本的特征之一，有生命存在，新陈代谢的过程就存在；新陈代谢一旦停止，死亡也将来临。
新陈代谢：简称代谢，是活细胞内发生的各种化学反应的总称，它包括分解代谢和合成代谢两个过程。
分解代谢：指细胞将大分子物质降解成小分子物质，并在这个过程中产生能量（以ATP形式存在）和还原力(以[H]表示)。分解代谢又称异化作用。
合成代谢：指细胞利用简单的小分子物质合成复杂大分子的过程，在这个过程中要消耗能量。合成代谢又称同化作用。
新陈代谢按物质转化方式分：
物质代谢：物质在体内转化的过程。
能量代谢：伴随物质转化而发生的能量形式相互转化
▲新陈代谢按代谢产物在机体中的作用不同分：
初级代谢：提供能量、前体、结构物质等的代谢类型
次级代谢：在一定生长阶段出现代谢产物的类型。
ED途径：
Glc只经过4步反应就可形成Pyr。此途径存在于某些缺乏完整EMP途径的微生物中。
ED途径与EMP途径、TCA循环、HMP途径、酵解、生醇发酵都有联系。
三、肽聚糖的生物合成
肽聚糖是原核生物细胞壁的组成成分，是抗生素选择毒力的物质基础，合成过程中必须运送到细胞膜外完成装配。
肽聚糖的合成过程大约有20步，研究对象主要采用G+细菌——金黄色葡萄球菌。
▲根据反应部位的不同，可分成在细胞质中、细胞膜上和细胞膜外3个合成阶段。
G：葡萄糖；G :N-乙酰葡糖胺；M：N-乙酰胞壁酸；“park”核苷酸：UDP-N-乙酰胞壁酸五肽
（一）在细胞质中的合成
1、由Glc合成N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸
2、由N-乙酰胞壁酸合成“Park”核苷酸
“Park”核苷酸：尿嘧啶二磷酸-N-乙酰胞壁酸五肽
（二）在细胞膜中的合成
由“Park”核苷酸合成肽聚糖单体。 p13
三步骤：
（三）在细胞膜外的合成
在细胞膜外，原有的肽聚糖分子成了新合成分子的引物。从细胞膜上运送来的肽聚糖单体与引物发生转糖基作用，使多糖链在横向上延伸一个双糖单位。
然后再通过转肽酶的转肽作用，最终使前后两条多糖链间形成甘氨酸五肽“桥”而发生纵向交错。
▲青霉素的作用机制：青霉素是肽聚糖单体五肽尾末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸的结构类似物，相互竞争转肽酶的活力中心，阻碍肽聚糖的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。
注意：细胞壁的合成发生于细菌的繁殖期，故青霉素类只对繁殖期的细菌起作用，对处在静止期的细菌几乎无作用，所以常称这类药为繁殖期杀菌药。
第七章 微生物的生长及其控制
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩大的生物学过程。是逐渐发生的量变的过程。
个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。是质变的过程。
群体生长：可以定义为在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。既有量变也有质变。
三者之间的关系：
个体生长 → 个体繁殖 → 群体生长
群体生长 ＝ 个体生长 ＋ 个体繁殖
由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
微生物在固体培养基平板上分裂生长形成肉眼可见的细胞群，即菌落。一个菌落中的成员全部来自于一个单个的祖先，因此菌落是比较纯的。
附：微生物的分离方法
微生物的培养分离，是研究和利用微生物的第一步，是微生物工作中最重要的环节之一。要对某种微生物进行仔细研究，就必须获得该微生物的纯培养。
从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养物。
▲ 微生物的分离方法主要有稀释倒平板法、划线法、单细胞挑取法、利用选择性培养基分离法等。
1、稀释和倾注平板技术
该法适用于细胞较大的微生物。如果稀释得当，平皿上可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌或微生物繁殖而成的，随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。
2、平皿划线分离法
平板划线方法可以得到菌落纯
注意：在划线分离时，每划完一个区域后都要对接种环进行火焰灭菌，以数字序号顺序划线。
微生物将随着划线次数的增加而分散，经保温培养形成菌落，划线开始的部分细菌分散度小，形成的菌落往往连在一起；由于连续划线，微生物逐渐减少，划到最后，常可形成单个孤立的菌落，这种单个菌落可能由一个细胞繁殖而来，故可获得纯培养。
3、单细胞挑取法
这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养。
具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上，把一滴细菌悬液置于载玻片上，用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管，在显微镜下对准某一个细胞后挑取，再接种于培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员，多限于高度专业化的科学研究中采用。
兴趣题：一个菌落不同部位的细胞生长有何区别？为什么会有这种区别？
4、利用选择性培养基分离法
加富性选择培养基 / 增殖培养基：根据所需分离微生物的特殊营养需求，“投其所好”，使待分离M.B大量生长繁殖成为优势菌群，达到富集或增殖的目的，便于分离。
抑制性选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，这种化学物质没有营养作用，对所需分离的微生物无害，但可以抑制或杀死其他微生物
第一节 测定生长繁殖的方法
微生物生长量的测定是研究微生物群体生长规律、动力学特性、细胞成分分析、生理生化特性分析及培养与管理的基础。
可用很多方法来测定总细胞数量、活的微生物数量、细胞重量等来研究微生物的生长。
测定方法：
直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；
间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
一、测生长量
（一）直接法
1、测体积
这是一种粗放的方法。将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。又叫30 min沉淀率。 该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。 正常范围为15~30%。
2、称重
此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。 包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
以上都是液体培养时的称重法。
如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌，可先加热至50℃，使琼脂熔化，过滤得菌丝体，再用50℃的生理盐水洗涤菌丝，然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。
（二）间接法
（1）比浊法
采用分光光度计对微生物菌悬液进行测定，波长通常在450~650 nm之间。
原理：细胞越多，浊度就越大，则分光光度计测量的光密度值（OD值）就越大。对于单细胞微生物，在一定范围内OD值与细胞总数成正比关系。
吸光值 透光率
2、生理指标法
微生物生长过程中，生长量与很多生理指标相平行，可以通过测定细胞的含N、C、P、DNA量等间接计算。
原理：若某物质在各细胞中的含量一样，那么细胞构造中这种物质的总量就与总的微生物细胞量直接相关。
氮量测定法：
细菌 含氮量6.5%~13%
霉菌 含氮量4.5%~8.5%
酵母菌 含氮量7.5%左右
粗蛋白含量=含氮量×6.25
方法有：凯氏定氮法、Nessler法、过氯酸消化法等。
二、计繁殖数
对于繁殖来说，一定要计算微生物的个体数目，所以计繁殖数只适用于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。
（一）直接法
直接法就是指在显微镜下直接观察细胞并继续计数的方法，所得的结果是包括死细胞在内的总菌数。
1、比例计数法
将已知颗粒浓度的液体与一待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，在显微镜视野中数出各自的数目，然后求出未知菌液中的细胞浓度。
2、血球计数板法
采用血球计数板测定一定体积中的细胞总数目的常规方法。测定中按统计学原理计数n格中微生物细胞数量，取平均值。
优点：此法容易、迅速、成本低、而且能观察细胞的大小和形态特征。
缺点：① 样品中细胞数量不能太少； ② 无特别的技术就不能区分死活细胞。
鉴别死活细胞可以先进行染色处理。 p151
原理：美蓝进入活细胞后，可被还原脱色，而死细胞及代谢缓慢的老细胞，无还原能力可被着色，借此可区分活菌和死菌。
（二）间接法
活菌计数法。
液体培养基变浑浊、固体培养基上（内）长菌落。菌落计数法最常用。
原理：活菌能在固体培养基上（内）形成菌落。
1、倾倒平板法/浇注平板法/混菌法
方法：取一定体积的稀释菌液与合适的固体培养基在其凝固前（50℃左右）均匀混和。保温培养。
稀释平板计数时，在一个9cm直径的培养皿平板上，不同种类微生物的稀释度计数标准是：
细菌：50~500个菌落；放线菌：30~300个菌落；真菌：10~100个菌落
CFU PFU 菌落计数器
从平板上（内）出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液中含有的活菌数（一个菌落来源于一个活细胞）。
2、涂布平板法
a—将少量样品加到已凝固的琼脂平板中央；b—将玻璃三角棒浸入酒精；c—将蘸有酒精的涂布棒在火焰上灼烧后冷却；d—均匀涂布后适当条件下培养
方法：取一定体积的稀释菌液，涂布于已凝固 的固体培养基平板上。保温培养。
从平板上出现的菌落数乘上菌液的稀释度，即可计算出原菌液中含有的活菌数（一个菌落来源于一个活细胞）。
问题1：为什么倾倒平板法/混菌法的结果有时会低于涂布平板法的结果？
混菌法：少量稀释样品与冷却到45~50℃的液态琼脂培养基均匀混合，大多数细菌和真菌在此温度下不会被杀死。当琼脂凝固后，每个细胞都被固定在M中的一定位置，在适当条件下培养后，这些分散的细胞分别形成单菌落。但是，若熔化的琼脂培养基温度过高，会杀死或损伤一些对温度较为敏感的细胞，因此······
问题2：平板划线可以获得纯培养物，是否也可以用于活菌计数？
问题3：在实际情况中，为什么有时CFU并不完全等同于样品中的活菌数？
如果样品中的细胞聚集成团，没有有效地分散开，就不可能保证每个菌落来源于一个细胞，就会导致计数结果（CFU）偏低。因此，在这种情况下的CFU并不完全等同于样品中的活菌数。
3、滤膜培养法
方法：使样品滤过一种特制的，孔径小于细菌个体的滤膜，然后将滤膜置于培养基上或浸润有液体培养基的垫状物上培养，通过计算在滤膜上形成的菌落数就可知样品中的活菌数。
水的洁净分析 p249
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长
1、微生物的个体生长
细菌的个体生长包括细胞结构的复制与再生、细胞的分裂与控制。
（1）染色体DNA的复制和分离
细菌在个体生长过程中通过染色体DNA的复制，使其遗传特性能保持高度的连续性和稳定性。
（2）细胞壁扩增
细胞壁是细胞外的一种“硬”性结构。细菌在生长过程中，细胞壁只有通过扩增，才能使细胞体积扩大。
（3）细菌的分裂
当细菌的各种结构复制完成之后就进入分裂时期，将一个细菌分裂成两个大小相等的子细菌。
2、微生物的同步生长
在分批培养中，细菌群体能以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂。也就是说，培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。显然，如果以群体测定结果的平均值代表单个细胞就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。
Ø 同步生长：培养物中所有的微生物细胞都处于同一生长阶段，并能同时分裂的生长方式。
n 同步培养法：使培养基中所有微生物细胞处于相同的生长阶段的培养方法。
用同步培养法所得到的细胞叫同步细胞或同步培养物。
意义：采用同步培养技术就可以用研究群体的方法来研究个体水平上的问题。
获得同步生长的方法：（一）机械法
依据：处于同一生长阶段的细胞的体积、大小相同。
1、过滤分离法：应用各种孔径大小不同的微孔滤膜，可将不同步的大小不同的细胞分开 ，然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。
2、离心法：通过密度梯度离心就可使处于不同生长阶段的大小不同的细胞群体在一定程度上分开，然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。
3、硝酸纤维素滤膜法 常用
（二）环境条件控制技术
★二、单细胞微生物的典型生长曲线
除某些真菌外，我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个，而是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。
▲分批培养：在一个密闭系统内一次投入液体培养基，一次接种，经过若干时间的培养后再将培养液一次放出的培养操作类型。
生长曲线：即分批培养生长曲线。以培养时间为横坐标，以细胞数目的对数值为纵坐标，绘制所得曲线。
一条典型的生长曲线至少可以分为迟滞期、指数期（对数生长期）、稳定期和衰亡期等四个生长时期。
1、 迟滞期
（1）现象
活菌数没增加，曲线平行于横轴。
通常，细菌、酵母菌的迟滞期最短，霉菌次之，放线菌最长。
（2）产生原因
由于微生物进入新环境，代谢系统有一个适应过程。因此，延滞期又叫调整期或适应期。产生的原因可能是：
①接种后，新的M与原来的M成分不同，细胞需要时间合成新的酶来利用新的营养物质；
②接种后，细胞内的一些关键小分子、离子或酶由于稀释作用导致浓度下降，恢复到原来水平需要时间；
③种子较老，缺乏ATP，必需的辅助因子及核糖体；
④细胞可能受损伤而需要一段时间恢复。
（3）细胞特点
① 生长速率为0；
② 细胞形态变大或变长；
③ 细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高；
④ 合成代谢活跃，易产生各种诱导酶（为适应环境）；
⑤ 对外界不良条件（如NaCl溶液浓度、热、紫外线、X-射线、抗生素等物理化学因素）反应敏感。
（4）影响延滞期长短的因素
① 菌种
通常，细菌、酵母菌的迟滞期最短，霉菌次之，放线菌最长。
通过遗传学方法改变种的遗传特性使延滞期缩短，选用繁殖快的菌种。
② 接种龄
接种龄：是指种子罐中培养的菌种开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。
接种龄以菌种处于生命力极为旺盛的对数生长期末期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适。此时的种子能很快适应环境，生长繁殖快，可以大大缩短延滞期。
过于年轻的种子接入种子罐或发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、整个发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟。
过老的种子会引起生产能力下降而菌体过早自溶。
实际中，最适合的接种龄应通过多次实验确定。
③ 接种量
接种量：是指移入的种子液与接种后培养液体积的比例。
接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。适当扩大接种量可缩短延滞期，克服不良的影响。
当种子量多时，种子液中含有大量体外水解酶类，有利于对基质的利用，并且生产菌迅速被占据了整个培养环境，则可减少染菌的机会。p154图6-2
但是，如果接种量过多，造成培养液粘度增加，溶解氧不足等。
接种量一般为10 %（V/V）。
④ 培养基成分
培养基成分相差太大，接种后细胞适应时间长。所以，应尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大，以缩短适应时间。
在发酵中，常使发酵培养基的成分与最后一级种子培养基的成分保持一致。
（5）缩短延滞期的措施
《微生物工程》内容
2.、数生长期/指数期
细菌经过迟滞期进入对数生长期，并以最大的速率（且生长速率不变）生长和分裂，导致细菌数量呈对数增加，而且细胞内各成分按比例有规律地增加。
（1）现象
细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。
（2）细胞特点
① 生长速率常数最高，代时最短且稳定。因为这时养分、空间较丰裕，而排出的代谢物还不足以影响生长。若培养基及培养条件适当，生长速度就更快。
在对数期，每个细胞以恒定时间间隔进行分裂，细胞数量以2n方式增加（因而细胞数量以指数或对数方式增加，下页表6.1）。细胞数目增加一倍所需要的时间称为代时或倍增时间。
* 假设代时是20 min
关于代时或倍增时间的计算 《微生物工程》
② 细胞生长平衡
a. 所有细胞组分呈彼此相对稳定速度合成；
b. 大小、组成、生理特征等均趋于一致。
* 若营养水平或其它环境条件改变，将导致不均衡生长。
③ 酶系活跃，代谢旺盛。
意义：对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定，大小比较一致，生活力强，因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料（进行生物化学、生理学方面的研究）。
（3）影响对数生长期长短的因素
① 菌种
代时随菌种而异。例如，大肠杆菌为12.5~17 min，枯草芽孢杆菌26~32min，结核分枝杆菌792 ~ 932 min。
② 营养成分
同一菌种，营养越丰富代时越短。
③ 营养物浓度
营养物在低浓度时影响菌体的生长速率，在高浓度时影响菌体的生长量。
★ 如果某营养物在较低浓度范围内可影响菌体的生长速率和生长量，称此营养物为生长限制因子。 （Monod方程要用到）
④ 培养温度
最适生长温度为最佳。
大肠杆菌（E.coli）在不同温度下的代时
|
温度（℃） |
10 |
15 |
20 |
25 |
30 |
35 |
40 |
45 |
47.5 |
|
代时（分） |
860 |
120 |
90 |
40 |
29 |
22 |
17.5 |
20 |
77 |
（4）对数生长期的意义
① 研究代谢和生理性能的好材料
② 生产中用其作种子
③ 增殖噬菌体的最佳宿主
3、稳定期
（1）现象
活菌数目不增不减（生长和死亡处于动态平衡），总菌数达到最大，曲线有下降的趋势。
最初表现是代时延长，菌体生长变得缓慢。
（2）产生原因
① 营养物质尤其是生长限制因子的大量消耗；
② 营养物的比例变得失调：例如C/N比不合适等；
③ 有毒代谢产物（如酸、醇、毒素及H2O2等）的大量积累；
④ 外界条件（如pH、氧化还原电位等）变得越来越不适宜。
（3）细胞特点
① 生长速率常数为0：新繁殖的细胞数等于死亡的细胞数，处于动态平衡。
② 代谢活动继续进行，并保持相当水平；
③ 芽孢杆菌开始形成芽孢，细胞内开始贮藏物质（如脂肪、PHB等）。
④ 菌体量达到最高值
生长得率表示了微生物对基质利用效率的高低。
⑤ 不仅是菌体量最高时期，还是代谢产物最多的时期。
主要是抗生素、氨基酸等次级代谢产物。
（4）影响稳定期长短的因素
菌种和培养条件。
（5）稳定期的意义
① 若以生产菌体或次级代谢物为目的，稳定期是最佳收获期。
② 对生物测定来说，稳定期是最佳测定时期。
如果及时采取措施，补充营养物或取走代谢产物或改善培养条件，可获得更多的菌体物质或代谢产物。
4、衰亡期（death phase）
（1）现象
① 总菌数不变，活菌数曲线下降。
② 细胞自溶（pH值上升）。
（2）产生原因
营养物质耗尽、有毒代谢产物的大量积累、理化环境的不利。
（3）细胞特点
① 细胞形态发生多行化，包括畸形和衰退形；
② 细胞内颗粒更明显，出现液泡；
③ 菌体自溶；
原因：细菌本身所产生的酶使细胞分解。
④ 芽孢杆菌释放芽孢；
⑤ 生理代谢活动停滞。
（4）影响衰亡期长短的因素
衰亡期与其它各期比较相对较长，其时限决定于细菌本身遗传性能及环境条件。低温、隔绝空气均能延长这个时期。
注意：以上是单细胞M.B（如细菌、酵母）分批培养正常生长所经过的各个生长期。 但丝状菌（如放线菌、霉菌）没有对数生长期。
生长曲线各时期特点的比较
|
|
延滞期 |
指数期 |
稳定期 |
衰亡期 |
|
生长速率常数 |
0 |
最大值 |
0 |
负值 |
|
代时 |
较长 |
短 |
较短 |
长 |
|
细胞形态 |
大或长 |
正常 |
较正常 |
易变，自溶 |
|
生理代谢 特性 |
RNA含量高，细胞质呈碱性，对不良条件敏感，合成诱导酶，合成代谢旺 |
平衡生长，酶系协调，合成代谢与分解代谢平衡 |
细胞内累积贮藏物，合成次生代谢产物，形成芽孢 |
蛋白酶活跃，分解代谢旺，分泌次生代谢物，释放芽孢 |
|
细胞浓度 |
最低 |
较高 |
最高 |
快速降低 |
|
用作种子后 |
生长延期滞长 |
生长延期滞短 |
生长延期滞中等 |
生长延期滞长 |
三、微生物的连续培养
在分批培养中，培养液中的细胞浓度、基质浓度和产物浓度均随时间不断发生变化，处于一个不稳定的过程。必需营养物质的消耗或毒性产物的积累造成微生物生长的减慢和停止。
连续培养：当微生物以分批培养方式培养到对数生长期的后期时，一方面以一定的速度连续流入新鲜培养基和新鲜空气（指对好氧菌），并立即搅拌均匀，同时利用溢流方式（以相同速度 ）连续不断流出含有产物和细胞 的培养液，使培养器内的微生物长期处在适宜的培养基中，并保持指数期方式生长，借以提高微生物的生长的代谢效率。
连续培养时pH值、温度、营养成分的浓度、溶解氧等保持一定，微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上，所以培养基中微生物的生长和代谢活动始终保持旺盛的稳定状态。
∴ 连续培养过程近似恒态。
连续培养器的类型同样很多，如下表：
连续培养重要特征是使微生物增殖速度和代谢活性处于稳定状态。连续培养方法按控制方法可分为恒浊器法和恒化器法。
恒浊器法和恒化器法的比较p158 表6-3
和分批培养相比，连续培养的优点有：
① 可以维持稳定的操作条件，所以产品质量相对稳定；
② 能实现机械化和自动化，降低了劳动强度，减少了染菌机会；
③ 减少设备清洗、准备和灭菌等非生产时间，提高了设备利用效率；
④ 容易对过程进行优化。
连续培养法的缺点：
① 需要专门仪器，投资高；
② 由于是开放系统，加上反应周期长，容易染菌；
③ 在长周期连续培养中，菌种易于退化；
④ 营养物的利用率一般低于单批培养；
⑤ 新加入的培养基与原有的培养基不易完全混合，影响培养和营养物质的利用。
四、微生物的高密度培养
主要局限在大肠杆菌（E.Coli）和酿酒酵母的研究上。
▲高密度培养：是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养的10倍以上时的生长状态或培养技术。
以E.Coli为例，进行高密度培养的方法主要有：
（1）选取最佳培养基成分和各成分含量
（2）补料
（3）提高溶解氧的浓度
（4）防止有害代谢物的生成
第三节 影响微生物生长的主要因素
微生物的生长繁殖以多种营养物质为基础，但同时又受到各种环境因素的制约，如环境条件不适宜，微生物的生命活动就会受到影响，甚至发生变异或死亡。
▲环境条件包括：温度、pH值、氧气、氧化还原电位、渗透压、化学物质、辐射和超声波等。
一、温度
1、三种基本温度（or生长温度三基点）
图 温度对生长速率及细胞内大分子的影响
n 高温之所以能杀菌，最主要原因是高温使蛋白质变性凝固。
u 各种微生物耐高温的程度大不相同，最大的区别在于它们是否能够产生耐热的芽孢。芽孢是耐高温的，但是各种芽孢耐热的程度又不同。
u 微生物对低温的抵抗力一般比对高温的抵抗力强。低温只能抑制微生物的生长，但其致死作用较差。所以，可以利用低温保存菌种。
各种微生物都有其生长发育的最适温度。大多数微生物的最适生长温度在25~27℃，在此温度范围内，微生物生长繁殖最快。
温度和微生物生长的关系有两方面：
u 通常温度每升高10℃，生长速度就加快1倍。
u 其次，不同生长阶段对温度的反映不同。
2、按最适生长温度 将微生物分类
嗜冷菌（＜20℃）
中温菌（20℃～45℃）
嗜热菌（＞45℃）
（1）最低生长温度：微生物生长的最低温度一般在–10℃～–5℃，极端的可达–30℃。低于最低生长温度， M.B的生长受到抑制。
（2）最高生长温度：微生物生长的最高温度一般80~95℃，极端的105~150℃。超过最高温度，M.B变性死亡。
（3）▲最适生长温度：微生物代时最短或生长速率最高时的培养温度。通常是一范围。简称“最适温度”。
对于同一微生物来说，其不同的生理生化过程有着不同的最适温度。
▲也就是说，最适生长温度
l 并不一定等于菌体生长量最高时的培养温度；
l 也不一定等于发酵速度最高时的培养温度；
l 也不一定等于积累某一代谢产物量最高时的培养温度。
二、氧气
按照与氧的关系，可将微生物分为好氧微生物（好氧菌）和厌氧微生物（厌氧菌）两大类，并可进一步细为5类：
兼性好氧微生物/兼性厌氧微生物：既可在有氧条件，又可在无氧条件下生长的微生物。
1、专性好氧微生物与氧的关系
必须在较高氧浓度下才能生长的微生物，氧的作用：
一是作为好氧呼吸的最终电子受体；
二是参与体内甾醇和不饱和脂肪酸的生物合成。
虽然好氧微生物在利用氧进行好氧呼吸时会产生的有毒的过氧化物（例如把O2分解成H2O2），但因为细胞内具有相应的过氧化氢酶、过氧化物酶，可将H2O2再分解成H2O和O2，所以不会中毒。
好氧微生物需要的氧主要是溶解在水中的溶解氧（DO），DO受温度、大气压等因素的影响，若污水中含有机物，则DO更低。
增大DO值的常用方法：①通气（空气或纯氧）；② 搅拌（实验室里可用摇床振荡）。
2、兼性厌氧微生物与氧的关系
因为既具有脱氢酶又具有氧化酶，所以，它们既能在无氧条件又能在有氧条件下生存。
在有氧条件下生长，氧化酶活性强，具备完整的呼吸链；
在无氧条件下，细胞色素和电子传递体系的其他组分减少或缺失，氧化酶无活性。
在无氧环境生活的兼性厌氧菌一旦进入有氧环境，则呼吸体系很快恢复。
3、专性厌氧微生物与氧的关系
分布：湖泊、河流和海洋的沉泥中；泥潭、沼泽、积水的土壤中；污水或污泥的厌氧处理系统中。
根据对氧的敏感性，可分为：
专性厌氧微生物：在绝对无氧的条件下生存，一遇氧就死亡，如所有产甲烷菌等；
兼性厌氧微生物：在有氧的环境中，既不利用氧，也不会中毒，如大多数的乳酸菌。
专性厌氧微生物生境中要杜绝氧的原因：
（1）在有氧条件下，专性厌氧微生物代谢产生的NADH2和O2反应生产H2O2和NAD+，由于其体内不具有过氧化氢酶，这样将被生成的H2O2杀死。
（2）微生物还可由O2产生一种具有强氧化性的游离的氧原子O2·，专性厌氧微生物不具有超氧化物歧化酶而被O2· 杀死.
三、pH值
Ø pH值反映了溶液中氢离子浓度的大小。
Ø 绝大多数微生物的生长pH都在5~9之间。
Ø 三种基本pH值：最低pH值、最高pH值、最适pH值范围。
Ø 微生物生长有最适pH值，微生物发酵也有其最适pH值。微生物生长的最适pH与发酵的最适pH往往不同。
pH值的影响主要表现在：
（1）pH值影响细胞膜的电荷分布，从而影响M.B对营养物质的吸收；
（2）pH值影响酶的活性，从而影响代谢过程；
（3）pH值还影响基质和产物的解离，从而影响营养物质的吸收和代谢物质的排除。
不同种类的微生物对环境pH值的要求也不同。
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生物类别 |
最低值 |
最适范围 |
最高值 |
|
细菌 |
5.0 |
6.5~7.5 |
10.0 |
|
放线菌 |
5.0 |
7.0~8.0 |
10.0 |
|
专性嗜酸菌 |
1.0 |
3.0~3.4 |
7.0 |
|
酵母 |
2.5 |
4.0~5.8 |
8.0 |
|
霉菌 |
1.5 |
3.8~6.0 |
10.0 |
培养容器中的pH值并不是一成不变的，M.B的代谢活动能降低pH值两个单位；变化了的pH值又反过来影响M.B的生长和代谢。因此，需要采取措施控制培养液的pH值相对稳定。 《微生物工程》
注意：虽然微生物外环境的pH值变化很大，但细胞内环境的 pH值却相当稳定，一般都接近中性。
四、氧化还原电位
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微生物 |
需要的氧化还原电位环境 |
最适氧化还原电位范围 |
|
好氧微生物 |
> 0.1 V |
0.3~0.4 V |
|
兼性厌氧微生物 |
> 0.1 V时进行好氧呼吸 < 0.1 V时进行发酵或无氧呼吸 |
|
|
厌氧微生物 |
-0.25 V ~ -0.2 V |
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（一）影响因素
1、氧分压
氧分压越高，氧化还原电位越高。
在微生物的培养过程中，由于微生物的生长繁殖消耗大量的O2，分解有机物时还产生了H2或H2S等还原性物质，导致系统的氧化还原电位降低，并在对数生长期达到最低点。
2、pH值
pH越高，则氧化还原电位越高。
（二）氧化还原电位的控制
1、低电位控制
一般加入还原剂，如维生素C、H2S、含巯基有机化合物（半胱氨酸、GSH、二硫苏糖醇等）、铁、H2等；
2、高电位控制
氧化剂（如氢氧化铁等）。通常是通入空气或O2。
五、水的活度与渗透压
“结合水”：不能被微生物利用；
“游离水”：可以被微生物所利用。
游离水的多少可用水活度aw来表示。水活度是指在相同的温度和压力下，溶液中水的蒸汽压与纯水的蒸汽压之比，即：aw=p/p0
式中 p—溶液中水的蒸汽压；p0—纯水的蒸汽
纯水的活度为1.00，当水中有溶质时，aw<1
可以从气相的相对湿度值（用湿度计测）得到溶液的水活度aw 值。例如，空气的相对湿度为75%，此刻溶液的aw值为0.75。
相对湿度是指空气中实际含有的水蒸气量（绝对湿度）与当时温度下饱和水蒸气量（饱和湿度）的百分比。
相对湿度 = 绝对湿度 / 饱和湿度×100%
aw 值也可以用水活度分析仪直接测。
低渗或高渗溶液对微生物的生长都是不利的。高渗溶液（极低水活度）会使细胞脱水，发生质壁分离或死亡；低渗溶液（极高水活度）会引起细胞膨胀而死亡。
溶液的渗透压与其浓度成正相关性：浓度越高渗透压越大。
盐腌、糖渍是常用的提高食品渗透压的保藏方法。它能造成微生物的高渗状态，夺取微生物体内的水分，使微生物不能生存。 盐腌不仅防腐，还可以增加食品风味。在腌制食品时要注意盐的份量，过多会影响味道，过少达不到防腐目的。一般腌制中食盐含量在8％~10％为宜。在此浓度上可抑制多种腐败菌和致病菌繁殖。
此外，在腌制过程中应注意尽量在低温环境条件下进行，以免腐败菌或致病菌在盐还没有充分浸入的部分繁殖。盐腌食品中所含的维生素C损失较多，其营养价值较原来低。
新鲜蔬菜放久了会产生亚硝酸盐，腌制过程中也会产生。
亚硝酸盐的含量在腌制过程中有一个明显的增长高峰，一般情况下，腌制品在被腌制的4～8天内亚硝酸盐含量最高，第9天后开始下降，20天后开始消失，这个时候就可以食用了。VC能与亚硝酸盐发生还原反应，阻止致癌物质的生成，可在饭前或饭后口服VC。
糖渍法是利用高浓度（60％~65％以上）糖涂作为高渗溶液来抑制微生物繁殖。此类食品必须在密封和干燥条件下保存。因为糖极易吸收空气中的水分，使防腐作用降低。常见的糖渍食品有果脯、蜜饯、果酱等。
六、抗生素
▲抗生素：是一类由微生物合成或半合成的化合物。在很低浓度下能杀死或抑制其它微生物的化学物质。
对微生物生长的影响表现在以下几方面：
a抑制细胞壁的合成；b影响细胞膜的功能；c干扰蛋白质合成；d阻碍核酸的合成。
七、辐射与超声波
八、有毒化学物
1、重金属及其化合物
大多数重金属及其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂，其中作用最强的时Hg、Ag和Cu。
杀菌机理：有的与蛋白质结合使其变性；有的与酶上的-SH结合使酶失去活性，从而抑制微生物的生长或导致其死亡。
2、有机化合物
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类型 |
名称及使用浓度 |
作用机制 |
应用范围 |
|
醇类 |
70~75%乙醇 |
溶解类脂，脱水作用，蛋白质变性 |
皮肤、器械 |
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酚类 |
3~5%石炭酸 |
蛋白质变性，损伤细胞膜 |
地面、家具、器皿 |
|
3~5%煤酚皂(来苏尔) |
蛋白质变性，损伤细胞膜 |
皮肤 |
|
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醛类 |
5%~10%甲醛 |
破坏蛋白质氢键或氨基 |
物品消毒、接种室的熏蒸 |
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15mL/m3福尔马林 |
凝固蛋白、与氨基结合 |
无菌室、发酵车间的消毒 |
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2%戊二醛(pH8.0) |
破坏蛋白质氢键或氨基 |
精密仪器等的消毒 |
