一、青霉素的发酵工艺过程
1、工艺流程 (1)丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管(25°C,孢子培养,7天)——斜面母瓶(25°C, (2)球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管(25°C,孢子培养,6~8天)——亲米(25°C, 2、工艺控制 (1)影响发酵产率的因素 基质浓度 在分批发酵中,常常因为前期基质量浓度过高, (2)温度 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别 , 但一般认为应在25 °C 左右。温度过高将明显降低发酵产率 , 同时增加葡萄糖的维持消耗 , 降低葡萄糖至青霉素的转化率。对菌丝生长和青霉素合成来说 , 最适温度不是一样的, 一般前者略高于后者, 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的温度,以缩短生长时间, 到达生产阶段后便适当降低温度 , 以利于青霉素的合成。 (3) pH 值 青霉素发酵的最适 pH 值一般认为在 6. 5 左右 , 有时也可以略高或略低一些 , 但应尽量避免 pH 值超过7.0, 因为青霉素在碱性条件下不稳定, 容易加速其水解。在缓冲能力较弱的培养基中, pH 值的变化是葡萄糖流加速度高低的反映。 (4)溶氧 对于好氧的青霉素发酵来说 , 溶氧浓度是影响发酵过程的一个重要因素。当溶氧浓度降到 30% 饱和度以下时, 青霉素产率急剧下降, 低于 10% 饱和度时, 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高 , 说明菌丝生长不良或加糖率过低, 造成呼吸强度下降, 同样影响生产能力的发挥。 (5)菌丝浓度 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度, 从而使氧传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。 (6)菌丝生长速度 用恒化器进行的发酵试验证明,在葡萄糖限制生长的条件下, (7)菌丝形态 在长期的菌株改良中 , 青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要呈丝状生长和结球生长两种形 在丝状菌发酵中, 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度, 并避免结球 , 是获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中, 使菌丝球保持适当大小和松紧 , 并尽量减少游离菌丝的含量, 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。 3、 工艺控制要点 (1)种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、葡萄糖、 球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有O. 5% -1. 0 %玉米浆的三角瓶培养原始亲米孢子, 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 (又称生产米), 亲米和生产米均为25 °C静置培养, 需经常观察生长发育情况在培养到 3-4 天, 大米表面长出明显小集落时要振摇均匀, 使菌丝在大米表面能均匀生长, 待10 天左右形成绿色孢子即可收获。 工艺要求将新鲜的生产米 (指收获后的孢瓶在10天以内使用) 接人含有花生饼粉、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内, (2)培养基成分的控制 a. 碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、蕉糖、葡萄糖等。 b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮,并补加无机氮源( c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G, 需在发酵液中加人前体。前体可用苯乙酸、苯乙酰胺, 一次加入量不大于0.1%, 并采用多次加入, 以防止前体对青霉素的毒害。 d. 无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等, 且用量要适度。另外, 由于铁离子对青霉菌有毒害作用, 必须严格控制铁离子的浓度, 一般控制在30 μg/ml 。 (3)发酵培养的控制 a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。 b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素, 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%,补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。 c. pH 值控制 对pH 值的要求视不同菌种而异, 一般为 pH 6.4-6.8, 可以补加葡萄 糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制pH值。 d. 温度控制 前期 2 5- 2 6 °C, 后期 23 °C, 以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e. 溶解氧的控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的30% 。通风比一般为1 : 0. 8L/(L ? min), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。 f. 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫, 可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成消泡剂 " 泡敌 " 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢 g. 发酵液质量控制 生产上按规定时间从发酵罐中取样 , 用显微镜观察菌丝形态变化来控制发酵。生产上惯称" 镜检 ",根据" 镜检 "中菌丝形变化和代谢变化的其他指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时间, 以获得最多青霉素。当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, 并出现个别自溶细胞, 这表示菌丝趋向衰老, 青霉素分泌逐渐停止, 菌丝形态上即将进入自溶期, 在此时期由于茵丝自溶, 游离氨释放, pH 值上升, 导致青霉素产量下降, 使色素、溶解和胶状杂质增多, 并使发酵液变蒙古稠, 增加下一步提纯时过滤的困难。因此, 生产上根据" 镜检 "判断, 在自溶期即将来临之际, 迅速停止发酵, 立刻放罐, 将发酵液迅速送往提炼工段 |
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