随着功能基因组研究的深入, 越来越多的基因表达蛋白作为免疫原用来制备特异性的单克隆抗体(mAb), 但是部分原核或真核表达的蛋白在制备过程中会用到洗涤剂, 当用这些蛋白制备抗体时, 如果不注意其中残留洗涤剂的影响, 往往在间接ELISA筛选时出现“假阴性”结果, 导致大量阳性克隆的丢失, 甚至抗体制备失败。在用含有洗涤剂的抗原包被ELISA板时, 洗涤剂残留过高, 会严重影响蛋白质的包被效率, 但在保证含有一定浓度抗原的前提下, 适当稀释含有洗涤剂的抗原, 反而可以大大提高筛选的阳性率和阳性克隆ELISA检测的A值。我们用本实验室已有的卵白蛋白(Ovalbumin, OVA)和卵运铁蛋白(Ovotransferrin, OT)及其相应的mAb作为模型, 系统的研究了在抗原中加入洗涤剂Triton X100对包被效率抑制的程度、相应的浓度范围以及解决的方法。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 OVA (Grade Ⅶ)和OT购于Sigma公司, 其相应的mAb antiOVA mAb No.12以及antiOT mAb No.2由本室制备。Triton X100购于华美生物公司, 96孔ELISA板购于CorningCostar公司, 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体购于Pierce公司, 显色底物ABTS购于Sigma公司, 酶标仪为BioRad公司产品。 1.2 缓冲液 (1)包被缓冲液: 0.05 mol/L碳酸盐缓冲液, pH9.5;(2)洗液: 0.15 mol/L PBS 加入体积比为0.5 mL/L的Tween20;(3)稀释液: 0.15 mol/L PBS加入体积比为30 mL/L的胎牛血清;(4)底物缓冲液: 0.1 mol/L柠檬酸盐磷酸盐缓冲液, pH5.0;(5)显色液: 5 mg ABTS加入到10 mL底物缓冲液中, 再加30 mL/L H2O2 20 μL, 充分溶解。 1.3 方法 1.3.1 确定不同浓度的Triton X100对抗原包被效率的影响用包被缓冲液分别稀释OVA和OT至2 mg/L, 然后用稀释好的抗原稀释Triton X100, 从1∶5 000开始做倍比稀释至1∶320 000, 再用含有不同浓度Triton X100的2 mg/L的抗原包被ELISA板, 做间接ELISA, 确定不同浓度的Triton X100对抗原包被的影响。 1.3.2 Triton X100初始浓度相同的情况下不同抗原浓度对包被效率的影响 将OVA和OT用0.15 mol/L的PBS分别配制成1 g/L、 0.5 g/L、 0.25 g/L的抗原溶液, 然后加入Triton X100, 使其终浓度为10 mL/L。用包被缓冲液稀释抗原, 从64 mg/L开始做倍比稀释至0.125 mg/L, 包被ELISA板, 做间接ELISA, 观察在相同Triton X100浓度的条件下, 抗原浓度对抗原包被效率的影响。 1.3.3 间接ELISA 将包被缓冲液稀释好的抗原加入ELISA板, 100 μL/孔, 4℃过夜。洗液洗3遍, 加入相应mAb杂交瘤细胞株的培养上清(抗体浓度约为5 mg/L), 100 μL/孔, 37℃孵育1 h, 然后用洗液洗3遍, 加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠Ig多克隆抗体, 100 μL/孔, 37℃孵育45 min, 洗液洗3遍, 用ABTS底物液显色15 min, 在405 nm波长处用酶标仪读取吸光度(A)值。 2 结果 2.1 确定Triton X100对抗原包被效率产生影响的浓度范围在OVA和OT包被浓度都固定2 mg/L的条件下, 1∶5 000(1 mL/L的Triton X100稀释5倍)稀释的Triton X100几乎可以完全抑制蛋白的包被效率, 其A值与阴性对照相同。随着Triton X100浓度的下降, 吸光度值逐渐上升, 当Triton X100在1∶320 000的浓度下, OVA和OT的A值分别为0.815和0.829, 是不含Triton X100抗原包被孔A值的47.10%和46.75%(OVA和OT的A值分别为1.73和1.773), 表明即使Triton X100在1∶320 000的稀释度下, 对包被效率依然有较强的抑制作用(图 1)。 图1 不同浓度的Triton X100对抗原(2 mg/L)包被效率的影响(略) 阴性对照: 为包被缓冲液(不含抗原和洗涤剂); 无洗涤剂对照: OVA和OT抗原浓度均为2 mg/L(不含洗涤剂). 2.2 Triton X100对不同抗原浓度包被效率的影响 含有洗涤剂的抗原在包被时, 其包被的效率会受到抗原浓度和洗涤剂浓度两个因素的影响, 稀释倍数较低时, 虽然抗原的浓度较高, 由于洗涤剂的浓度也高, 包被效率极低;随着稀释倍数的提高, 洗涤剂的抑制作用减弱, 虽然抗原浓度逐渐降低, 在一定抗原浓度范围内包被效率却明显升高;以OT为例, 当Triton X100浓度等于或大于16×10-5(v/v)时, 16 mg/L的抗原浓度包被效率几乎为零;当Triton X100浓度为8×10-5(v/v)时, 抗原包被浓度越高, A值越高, 如图2所示, 包被OT抗原的浓度为8 mg/L、 4 mg/L、 2 mg/L 时, 间接ELISA的A值分别为0.947、 0.826、 0.515;当Triton X100的浓度下降到2×10-5(v/v)时, 由于抗原的包被浓度下降, 包被效率明显下降, 但在不含Triton X100的同一抗原包被浓度下A值却高达1.536。 图2 Triton X100对不同抗原(蛋白)浓度包被效率的影响(略) 3 讨论 |
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