碳青霉烯酶的研究进展

tuer 2010-07-25

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碳青霉烯酶的研究进展

碳青霉烯类具有非常广泛的抗菌活性，因能抵抗大多数内酰胺酶的水解，故常用于产超广谱 -内酰胺酶（ESBL）和/或去阻遏 AmpC -内酰胺酶（AmpC）菌株引起严重感染的治疗但碳青霉烯耐药肠杆菌的出现，给临床治疗带来了极大困难。通常，革兰阴性菌对碳青霉烯类的耐药机制，一是 AmpC 酶过度表达联合OMP 丢失；二是 PBP 对碳青霉烯类亲和力的改变；三是碳青霉烯酶（Carbapenemases）的产生在这些机制中，最突出的是碳青霉烯酶。

一、碳青霉烯酶的分类及有关细菌

碳青霉烯酶是指能够明显水解亚胺培南或美罗培南的一类β-2内酰胺酶 ,包括 Ambler分子分类的 A、 B、 D 3类酶。

A类为丝氨酸酶 ,其活性部位具有丝氨酸结构 ,属于 Bush分群中的第 2f亚组。A 类碳青霉烯酶少见 ,包括阴沟肠杆菌( I M I2 1和 NMC2 A)、黏质沙雷菌中由染色体介导的 NMC2 A、 Sme2 1、 Sme2 2、 Sme2 3、I M I2 1酶 ,以及肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌中质粒介导的 KPC1、GES2 2酶。这类酶都是青霉素酶 ,他们对亚胺培南的水解活性强于美罗培南 ,可以引起青霉素类、氨曲南、碳青霉烯类耐药 ,而对第 3代头孢菌素通常敏感。三唑巴坦、克拉维酸可以抑制此类酶 ,但不被乙二胺四乙酸 ( EDT A)所抑制。

Amble分类 D类为丝氨酸酶 ,属于 Bush分群中的第 2d亚组，其活性部位具有丝氨酸结构 ,由blaOXA等位基因编码 ,仅见于不动杆菌。

Amble分类 B类是金属酶 ,属于 Bush分类 3组 ,是一种需金属离子发挥活性的β-内酰胺酶 ,由 bla I MP、 blaV I M、 blaSPM和 blaGI M编码 ,可被EDT A所抑制 ,染色体介导或质粒介导,存在于多种不同革兰阳性和革兰阴性细菌中。金属酶均可明显水解亚胺培南,能水解除单环类抗菌药物以外的绝大多数β-内酰胺类抗菌药物,但对于其他β-内酰胺类抗菌药物的水解能力有较大差异。临床使用亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物大大增加, 导致金属β-内酰胺酶产生率有不断上升的趋势。目前尚未开发出有效的金属酶抑制剂。

二、碳青霉烯酶的研究进展

对碳青霉烯酶的研究主要着重于对A、B、D 3类酶的种类、分布、生化特性、流行病学等的研究和相关菌株耐药性的研究。

（一）A、D类碳青霉烯酶的研究

1、A类碳青霉烯酶的研究

自从 20年多前发现第一个 A 类碳青霉烯酶以来，至今已发现 6 群不同的酶，包括 GES、 KPC、 SME、 IMI/NMC-A 、SHV-38和 SFC-1，其中 GES、 KPC 和 IMI-2 由质粒编码，其他均由染色体介导依据Bush-J-M 分类系统，这些酶分为 4个不同的表型

亚群，即 2br 、2be、 2e 和 2f 亚群。与其他 A 类 -内酰胺酶一

样， A 类碳青霉烯酶利用活性位点丝氨酸残基灭活 -内酰胺类药物，可水解青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类和碳青霉烯类，这种活性可被克拉维酸和他唑巴坦所抑制，但对 EDTA 不敏感。

成熟A 类碳青霉烯酶是单体酶，含有 265~269 个氨基酸残基，分子量为25~32kDa， pI 为 5.8~9.7。与其他丝氨酸酶一样， A

类碳青霉烯酶也通过 3 步催化机制（包括酰化和脱酰基）来发挥作用。与 D 类和 B 类碳青霉烯酶一样，对美罗培南的水解率低于亚胺培南，但对美罗培南的亲和力却始终高于亚胺培南。

尽管A 类碳青霉烯酶群体中的氨基酸序列一致性较低，但却具有能使它们水解碳青霉烯类的相似的蛋白折叠（Proteinfolds）。除SHV-38 以外， A 类碳青霉烯酶的一个共同特征，是在Cys69和 Cys238之间均含有一个二硫键，这个键可以稳定蛋白折叠。二硫键是水解所有 -内酰胺类所必需的，并非仅针对碳青霉烯类的水解，它是稳定酶结构的一种需要。

目前，产 A 类碳青霉烯酶菌株感染仍较少见，大多为零星出现 SME、IMI/NMC-A 和 SFC-1 均由染色体编码，尽管对碳青霉烯类表现为高水平耐药，但对超广谱头孢菌素仍保持敏感，因此，目前尚未引起广泛的临床问题。令人担忧的是 KPC 和GES 酶的出现与扩散。

2、D类碳青霉烯酶的研究

1993年 , PAT ON等报道的第一个具有碳青霉烯酶活性的β-2 内酰胺酶 ,纯化于 1985年分离于苏格兰爱丁堡病人的多重耐药鲍曼不动杆菌,命名为 AR I2 1。。直到 2000年 ,DONALD等对 AR I2 1酶的氨基酸进行序列分析 ,将其命名为 OXA2 23。2000～2004年之间 ,在世界各地又发现了 6种新的 D类碳青霉烯酶。随后又在许多国家碳青霉烯类耐药菌株中发现了 7种 D类酶。迄今为止 ,在 121种 OXA型酶种 ,至少有 45种具有碳青霉烯酶活性。

成熟 D类碳青霉烯酶含有 243～260个氨基酸残基 ,分子量为 23～35 . 5 kDa不等 , p I为 5 . 1～ > 9 . 0。该类酶对亚胺培南的水解速率是青霉素的 1%～3% ,对苯唑西林的水解速率是青霉素的 2倍 ,对三代头孢菌素的水解活性很弱;其活性可被他唑巴坦和克拉维酸所抑制。

对携带编码 D类碳青霉烯酶重组质粒的大肠埃希菌转化结合子或转化株的体外抗生素敏感性研究发现 ,它们对氨基青霉素和羧基青霉素高水平耐药 ,对脲酰基青霉素的敏感性不定 (仅 OXA2 40和 OXA2 48对哌拉西林耐药 ) ;对头孢菌素类 ,包括窄谱头孢菌素、氧亚氨基头孢菌素和 72 α2 甲氧基头孢菌素、氧头孢烯类以及单酰胺类均敏感 (仅 OXA2 48对头孢噻吩耐药 )。除了 OXA2 23显示哌拉西林在他唑巴坦存在下其M I C值降低 8倍以外 ,其他对克拉维酸和他唑巴坦的抑制作用不敏感。

通常 ,D类碳青霉烯酶表现出弱碳青霉烯水解活性 ,产该类酶的分离菌对碳青霉烯类的耐药 ,可能是同时伴有其他耐药机制的结果，如外膜孔蛋白丢失、泵出作用增强、青霉素结合蛋白 ( PBP)改变等。产 D类碳青霉烯酶 (OXA2 51除外 ) 均显示对亚胺培南和美罗培南的高水平 (M I C > > 8 mg/L ) 耐药 ,但在大肠埃希菌中仅表现为敏感性减低 (M I C ≤2mg/L),有力证明了其他耐药机制的存在。PO I REL等报道的产 OXA2 48的肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类高水平耐药 (M I C = 64 mg/L ) ,可能是由于该菌株 blaOXA2 48基因与IS1999联合导致 OXA2 48的过度产生、以及 36 kDa孔蛋白缺乏所致。产 OXA2 24的鲍曼不动杆菌中 ,由于 2种外膜孔蛋白

(22 kD和 33 kD)表达减低限制了外膜通透性 ,从而导致了对亚胺培南和美罗培南的高度耐药 (其 M I C分别为 128和 256mg/L)。而产生 OXA2 23和 OXA2 58的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类的高水平 (M I C≥32 mg/L)耐药 ,可能是 D类碳青霉烯酶的高度表达与泵出作用增强的结果。

此外 ,产 D类碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌也可对非β2 内酰胺类抗生素耐药 ,如氨基糖苷类、氟喹诺酮类、磺胺类、氯霉素和四环素等。

D类碳青霉烯酶主要分布于临床分离的铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌 ,以 OXA2 23最为流行 ,其次是 OXA2 58和 OXA240。1998年以来 ,产 OXA2 23不动杆菌引起的医院暴发感染见于世界各地 ,如巴西、英国、塔希提岛等。韩国某医院产 OXA2 23鲍曼不动杆菌的暴发感染持续了 8个月 ,涉及 36例病人。在我国 ,李蓉等报道了南昌鲍曼不动杆菌流行株 80%携带 OXA2 23基因。王辉等报道 ,在收集的来自 1999～2005年我国不同地区 11家教学医院的 221株亚胺培南耐药不动杆菌中 , 97 . 7%的菌株含有 OXA2 23样基因 ,说明 OXA2 23在我国广泛分布。

DA SI LVA等则报道了 1998～2003年分离于 3家葡萄牙大学医院 162株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌 ,所有菌株具有类似的多重耐药模式 ,包括亚胺培南耐药 (M I C > 32 mg/L)。结果显示 ,多重耐药鲍曼不动杆菌流行克隆携带blaOXA2 40 ,表明 OXA2 40在葡萄牙存在持续流行。2005年 , LO2LANS等报道了产 OXA2 40鲍曼不动杆菌在美国芝加哥多个城市引起的暴发感染 , 100株鲍曼不动杆菌中 , 97%均归于1个克隆 ,说明在该地区为鲍曼不动杆菌的单克隆传播。

实验已经证明 ,细菌产生针对某一底物的低水平活性酶 ,当这个底物存在时可能促进这个酶更有效。从广谱酶进化到超广谱酶、耐酶抑制剂酶或碳青霉烯酶的现象在产SHV酶的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌中已经得到证实。因此 ,可以预言 ,碳青霉烯类抗生素的广泛应用可能导致铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌产生更有效的水解酶 ,其前景另人担忧。

(二）相关菌株耐药性的研究

1、鲍曼不动杆菌耐药性及碳青霉烯酶的研究

　　鲍曼不动杆菌( A ci netobacter baumanni i , A .B aumanni i)是重要的医院感染病原菌 ,在发生于下呼吸道医院感染的革兰阴性病原菌中 ,其仅次于大肠埃希菌和铜绿假单胞菌 ,居第三位。其耐药率逐

年上升,出现了泛耐和全耐菌株 ,世界各地均有多重耐药 A . B aumanni i 导致医院感染流行的报道。在综合性医院的 ICU 及移植病房 ,常常因为多重耐药A . B aumanni i感染导致最终的治疗失败。鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药机制主要包括通透性降低、流出泵过度表达、碳青霉烯酶的产生。其中OXA型碳青霉烯酶是引起世界范围鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物耐药的最重要原因。

目前实验研究显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦较为敏感,对其他抗菌药物耐药情况严重;对耐碳青霉烯类药物的菌株多重耐药性尤其显著,临床应加强检测和监测。主要方法为PCR检测及基因序列分析。

魏艳艳对2005年安徽省部分医院(18家)临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药性进行了研究。结果显示鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率最低(6.4%)、其次为美罗培南(20.5%)和头孢哌酮/舒巴坦(29.7%) ,对四环素的耐药率最高(81.5%);其余抗菌药物耐药率均在50%左右或以上。采用聚合酶链反应扩增IMP、VIM、OXA型碳青霉烯酶基因并测序并采用ERIC-PCR方法进行产酶菌株的同源性检测显示安徽省18家医院分离出的耐亚胺培南和/或美罗培南鲍曼不动杆菌主要产OXA- 24型和IMP型碳青酶烯酶,部分菌株同时产2种或以上碳青霉烯酶,且少数产酶菌株间存在克隆传播现象。

冯红军等对在平顶山市第一人民医院收集到的亚胺培南耐菌株进行耐药性分析 , 并对碳青霉烯酶基因进行了检测。　217株鲍曼不动杆菌中头孢哌酮 /舒巴坦耐药率最低 ,其次是亚胺培南 ,再者是头孢他啶和哌拉西林 /他唑巴坦。产 OXA2 23型β2 内酰胺酶是鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的重要原因。周敏等的研究也显示携带 OXA-23型碳青霉烯酶基因的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药的耐药率高其编码基因为blaOXA-23。

另外，胡源等的研究表明碳青霉烯酶基因PCR扩增用于检测鲍曼不动杆菌特异性较高,但如果仅从扩增片段长度判断,存在出现假阴性的可能。

在国外，Heritier等通过质粒转导的试验证实Ade-ABC外排泵系统的过度表达联合 OXA 酶的表达可以共同导致较高水平的耐药可以推断临床中产碳青霉烯酶的不动杆菌对多种药物的多重耐药可能是由多种碳青霉烯酶共同作用并联合其他机制，例如药物靶位结合蛋白的变异导致与药物亲和力降低、细菌外膜蛋白通透性降低等所导致的高水平耐药，各种耐药机制之间的协同关系仍需进一步研究。

2、对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究进展

肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶( Klebsiella pneum oniaecarbapenemase , KPC酶 )最早在一株亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌中被发现。从 2000年以后 ,KPC酶家族陆续在美国的新英格兰和亚特兰大地区被发现 ,主要在克雷伯菌属中 ,也在其他菌株中被发现。由于肠杆菌是临床上重要的医院感染菌 ,其对碳青霉烯类抗菌药物的耐药给临床抗感染治疗带来了极大困难。

在我国，2008年冯雅君等收集浙江大学医学院附属第一医院2006年3月至9月住院患者连续分离、不重复的对碳青霉烯类抗生素敏感性下降的肺炎克雷伯菌10株，采用Etest法、电聚焦电泳(IEF)、聚合酶链反应(PCR)及序列分析、接合试验等分析得到10株菌株对p一内酰胺类抗生素呈多重耐药，但对多黏菌素．替加环素，复方SMz敏。质粒介导的KPC一2造成肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性下降．并短暂流行；携带KPC一2基因的临床菌株同时携带多种耐药基因。

近几年的研究表明KPC酶主要包括三类。

KPC 1酶 2001年有学者在美国北卡罗来纳州肺炎克雷伯菌中发现由质粒介导的 KPC 1酶。耐药表型表现出高度亚胺培南和美罗培南耐药性 ,当存在克拉维酸时 ,针对亚胺培南和美罗培南的β2 内酰胺酶活性被抑制;对头孢菌素类抗菌药物和氨曲南也耐药。KPC 1基因由大约 50 kb的非结合性质粒携带。基因测序显示 ,核苷酸序列不同于基因库中已有的编码β2 内酰胺类酶的基因。氨基酸序列分析显示 , KPC2 1与来源于黏质沙雷菌 S6的可水解碳青霉烯的β2 内酰胺酶 Sme2 1有45%的同源性 , 其他 3种 A类碳青霉烯酶 (Nmc2A、I M I2 1、 Sem2 1) 间在核酸水平上相互的相似性> 90% , 说明 KPC1酶可能具有与这 3种密切相关的 A类碳青霉烯酶不同的起源。 KPC 1酶是一种新的属于 A类 Bush 2f组的可水解碳青霉烯的β2 内酰胺酶 , 肺炎克雷伯菌 1534的碳青霉烯耐药性主要由 KPC 1酶介导 , 孔蛋白表达的改变可能也起了某种作用。

KPC 2酶　2002年报道 , 1998年在马里兰州一名 4岁腹泻患儿粪便里分离出一株沙门菌(AM04707) ,出现了耐大多数β2 内酰胺类抗菌药物和亚胺培南的表型 ,检测出 KPC22酶。2003年 ,国际癌症研究协会 ( I CARE)项目报道了在1998年纽约州医院发现一株产酸克雷伯菌 (产酸克 3127)产 KPC 2酶。KPC 2酶与 KPC 1酶有一个氨基酸的改变，S174G,分类也属于 A类 Bush 2f组。。KPC 2酶从肠炎沙门菌和肺炎克雷伯菌而来 ,DNA序列表明 ,编码 KPC 2的质粒与沙门菌中的质粒有 98%的同源性 ,因此 ,此质粒可在肠杆菌中结合而传播 KPC 2。KPC 2酶能单独引起碳青霉烯类耐药 ,不依赖于膜孔蛋白的丢失 ,基因由可转移的70 kb质粒编码 ,位于质粒的转座子上 ,具有高传播可能。Smith Moland等在一株肺炎克雷伯菌中发现 KPC酶的同时 ,表型试验检测到菌株超广谱β2 内酰胺酶 ( ES BL s)阳性 ,产 ES BL s为临床检测 KPC- 2酶带来一定困难。

KPC 3酶　2000年4月至2001年4月 ,纽约 TISCH医院的重症监护病房有 24例患者被感染了碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌 ,这是首次报道的亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌引起的感染。凝胶脉冲场电泳 ( PFGE)证实了此次医院感染由 3个不同的克隆株引起,分别为 CL5761、CL5762、 CL5763。聚合酶链反应 ( PCR)扩增发现了一种新的 KPC酶 — — —KPC 3酶。药敏结果显示 ,对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、哌拉西林、三唑巴坦、庆大霉素敏感性降低 ,但对四环素敏感。KPC2 3由 75 kb的质粒编码 ,可以结合转移。KPC3酶是由 882 bp的碱基编码的 293个氨基酸残基的肽链 ,和 KPC 1酶相比有 2个碱基的改变。可通过电穿孔转移和结合。结合实验发现 ,所有的 KPC结合子对碳青霉烯类的药敏比原菌株要敏感。KPC-1、KPC-3 酶均需要结合膜孔蛋白ompK35,其表达缺失引起对碳青霉烯类的耐药。

目前产 KPC酶的细菌已经在全球范围内广泛播撒,中国也已经报道,造成了对碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南在内的几乎所有β2 内酰胺类抗菌药物耐药,并且产 KPC酶的菌株种类正在增加,随时可能引起医院感染的爆发和流行,因此产 KPC酶细菌的感染将是我们面临的严重问题,应引起微生物学家和临床医师的高度重视。

3、铜绿假单胞菌的耐药性及碳青霉烯酶的研究进展

铜绿假单胞菌是一种常见的医院内获得性感染条件致病菌，在医院感染病原菌中检出率最高。该菌耐药性强，耐药谱广，对多种抗菌药物表现为天然或获得性耐药，故其所致感染可供选择的有效抗菌药物甚少。碳青霉烯类抗生素是目前临床上使用的抗铜绿假单胞菌较为有效的药物，但随着临床的广泛应用，铜绿假单胞菌对亚胺培南等产生了耐药性，使得临床上对耐碳青霉烯类抗生素的铜绿假单胞菌治疗极为困难。

从２０世纪９０年代有报道以来，铜绿假单胞菌耐药率呈明显上升势头。哥伦比亚一家有着１９５个床位的中心分离出的铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率从１９９６年的２％、１９９７年的２８％，到２００３年超过了4０％。中国上海２００４年分离出的２２８７株铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率为２1 ％。

其耐药机制主要有：①碳青霉烯酶的产生；②药物作用靶点的改变；③主动外排泵的过量表达；④高产AmpC酶伴外膜孔蛋白的丢失。碳青霉烯酶可由细菌染色体编码，也可由质粒编码，一旦染色体编码的耐药基因转移到可传递的质粒上，可与质粒上其它耐药基因组合在一起形成多重耐药，并导致耐药性的传播。OXA50型酶是唯一一个在铜绿假单胞菌中发现的D类碳青霉烯酶。该酶位于染色体上，它编码的蛋白质是poxB酶(D类)的前体。

郝维敏等用法国梅里埃公司的VITEK32全自动细菌鉴定与药敏系统检测其耐药性，用双纸片协同法检测铜绿假单胞菌产金属酶得出　IRPA（亚胺培南耐药的PA）对抗菌药物的耐药率明显高于ISPA（亚胺培南敏感的PA）且呈多重耐药 ,产金属酶是铜绿假单胞菌耐亚胺培南的主要机制之一。