Rt-PCR实验步骤 一、实验器具与材料: 1、移液枪:1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头:1ml、200μl、20μl 3、匀浆管:5ml 4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20μl吸头的一个 5、EP管:1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶:2个60ml的棕色试剂瓶(广口,带盖) 1个125ml的白色试剂瓶(放无水乙醇) 7、量筒:50ml、250ml、500ml 8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml 9、试管架:5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水 11、铝制饭盒:4个 12、塑料小饭盒:1个 13、大瓷缸:2个 14、锡泊纸:一卷 15、卷纸:2卷 16、三角烧瓶:带盖,稍大
二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等) 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,其中小枪头需要吸管打入DEPC水,过夜,然后高压,再烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管) 2、玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,蒙锡纸烤干备用(DEPC水泡)(洗净后先泡1‰DEPC过夜,再烤干) 3、匀浆器:(包括剪刀、镊子)先洗净后,再高压(不需要泡DEPC)
三、试剂配制: 1、DEPC水:吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇:用无水乙醇+DEPC水配,然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压) 3、异丙醇:放入棕色瓶中 4、氯仿:放入棕色瓶中 5、琼脂糖 四、几种缓冲液的配制: 1、电泳缓冲液: Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5M EDTA 20ml? pH8.0 蒸溜水 1000ml
5×TBE (贮存液) 再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用(即工作液浓度),如取50ml贮存液+450ml水——→500ml工作缓冲液
2、上样缓冲液: 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯青FF 30%甘油
6×缓冲液,4℃保存
五、琼脂糖凝胶的配制: 1、1.0%: 1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液,微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中,在室温下放置30-45min后现进行电泳。
2、1.5%: 同上,将琼脂糖的量改为1.5g
六、需购置的Rt-PCR材料: (生工. Tel. 2236106.) Taq酶(含MgCl2 Buffer) 200u 70.00 dNTP: 1支 oligo(dT)15: 1 OD 40.00 promega M-MLV: 1支 250.00 promega (Buffer) RNasin: 1支 110 —— -20℃
DEPC 5g 110.00 Trizol 100ml/1瓶 Invitrogen Life technologies —— 4℃
Marker: 10μg 0.2μg/ml 150.00 科威 (1543. 994. 697. 515. 377. 231) 七、引物合成 1、内参照: GAPDH 正义:5′—ACCACAGTCCATGCCATCAC—3′ 反义:5′—TCCACCACCCTGTTGCTGTA—3′
β-actin 正义:5′—CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC—3′ 反义:5′—TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT—3′
2、par-4: 正义:5′—GGGACCTCGGAACTCAAC—3′ 反义:5′—TGTATCTGCCTGGGACTG—3′
3、退火温度计算 2(A+T)+4(G+C) 正反义平均数,再上下波动度(±4℃,或±5℃)
4、引物各合成5 OD,每OD一瓶分装好
5、引物稀释: 加DEPC水量为(μl) = ? nmol / OD × 管上所标OD数×100 是为10p mol / μl 浓度的引物溶液
八、PCR产物电泳 先将1-10μl左右PCR产物,加已点在纸上的溴酸兰,反复吸打混匀后进行电泳,一般电流为10mA,电源100V,电泳30分钟,紫外灯下观察,满意的结果扫描打印。
九、几个注意点: 1、逆转录的关键步骤是立即冰水浴? 2、Rt时,先打开PCR预热30分钟。 3、RNA抽提前,打开离心机预冷。
在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。 在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。 外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
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电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
①电泳缓冲液
1. 50×Tris-乙酸(TAE)缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量
2mol/L Tris碱 242g
1mol/L 乙酸 57.1 ml的冰乙酸(17.4 mol/L)
100 mmol/L EDTA 200ml的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)
水 补足1L
2. 5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液
成分及终浓度 配制1L溶液各成分的用量
445 mmol/L Tris碱 54g
445 mmol/L 硼酸盐 27.5g 硼酸
10 mmol/L EDTA 20 ml的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)
水 补足1L
②染料
1. 1%溴酚蓝(bromophenol blue)
加1g水溶性钠型溴酚蓝于100ml水中,搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
2. 1%二甲苯青FF(xylene cyanole FF)
溶解1g二甲苯青FF于足量水中,定容到100ml。
3. 10mg/ml的溴化乙锭(ethidium bromide)
小心称取1g溴化乙锭,转移到广口瓶中,加100ml水,用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装液管,于4℃贮存。
③凝胶上样液(gel loading solutions)
1. 6×碱性凝胶上样液(室温贮存)
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.3 N 氢氧化钠 300ul 10N 氢氧化钠
6 mmol/L EDTA 120ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
18%聚蔗糖(400型) 1.8g
0.15%溴甲酚绿 15mg
0.25%二甲苯青FF 25mg
水 补足到10ml
2. 6×聚蔗糖凝胶上样液(室温贮存)
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.15%溴酚蓝 1.5ml 1%溴酚蓝
0.15%二甲苯青FF 1.5ml 1%二甲苯青FF
5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
15%聚蔗糖(400型) 1.5g
水补足到 10ml
3. 6×溴酚蓝/二甲苯青/聚蔗糖凝胶上样液(室温贮存)
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.25%溴酚蓝 2.5ml 1%溴酚蓝
0.25%二甲苯青FF 2.5ml 1%二甲苯青FF
15%聚蔗糖(400型) 1.5g
水补足到 10ml
4. 6×甘油凝胶上样液(4℃贮存)
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.15%溴酚蓝 1.5ml 1%溴酚蓝
0.15%二甲苯青FF 1.5ml 1%二甲苯青FF
5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
50%甘油 3ml
水 3.9ml
5. 6×蔗糖凝胶上样液(室温贮存)
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.15%溴酚蓝 1.5ml 1%溴酚蓝
0.15%二甲苯青FF 1.5ml 1%二甲苯青FF
5 mmol/L EDTA 100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
40%聚蔗糖 4g
水 补足到10ml
6. 10×十二烷基硫酸钠/甘油凝胶上样液(室温贮存)
成分及终浓度 配制10ml溶液各成分用量
0.2%溴酚蓝 20mg
0.2%二甲苯青FF 20mg
200 mmol/L EDTA 4ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)
0.1%SDS 100ul 10% SDS
50%甘油 5ml
水 补足到10ml[/size]