SDS-PAGE电泳

聚丙烯酰胺;PAM;polyacrylamide

　　聚丙烯酰胺简称PAM、结构式为[－CH2－CH(CONH2)]n－，分子量100～ 500万。聚丙烯酰胺主要有两种商品形式，一种是粉末状的，另一种是胶体，还有聚丙烯酰胺乳液(上海合成树脂研究所研制)。易溶于冷水，速度很慢，高分子量的聚丙烯酰胺当浓度超过10％以后．就会形成凝胶状结构。提高温度可以稍微促进溶解，但温度不得超过50℃，以防发生分子降解。难溶于有机溶剂。温度超过120 ℃时分解。中性。无毒。

用作增稠剂、絮凝剂、减阻剂，具有凝胶、沉降、补强等作用。贮存于阴凉、通风、干燥的库房内，防潮、避光、防热．存放时间不宜过长。

 

聚丙烯酰胺凝胶

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N￠，N￠—四甲基乙二胺(N，N，N￠，N￠—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。15905967149

聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：

(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；

(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；

(3)对pH和温度变化较稳定；

(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；

(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g

(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；

(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

 

分子量范围与凝胶浓度的关系

       分子量范围                 适用的凝胶浓度/(%)

                     蛋  白  质

        <10⁴                           20-30  

        1-4×10⁴                    15-20

     1-5×10⁴-1×10⁵                  10-15      

         1×10⁵                         5-10   

        >5×10⁵                           2-5   

                      核酸(RNA)             

         <10⁴                       15–20     

         10⁴–10⁵                      5-10

       10⁵-2×10⁶                    2-2.6      

 

ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶

在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS即十二烷基磺酸钠(CH₃-(CH₂)₁₀-CH₂OSO₃- Na+)，是一种阴离子表面活性剂即去污剂， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂β-巯基乙醇或DTT可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，经沸水浴煮3～5 min，使蛋白质 与SDS分子按比例充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，形成棒状结构的带负电荷的SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量的SDS，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS 分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS 掩盖，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异。由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移 速度仅取决于分子大小。SDS 与蛋白质结合后使蛋白质－SDS 复合物上带有大量的负电荷，当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分 子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它 的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
    样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于控制电泳过程。另外样品处理液中也可加入适量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加样时样品溶液可以沉入样品凹槽底部。

制胶

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。

制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是10⁴～10⁵，即分子量小于10⁴的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于10⁵的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶(孔径较大)；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶(孔径较小)可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶(约1cm)，并在浓缩胶上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径(丙烯酰胺浓度通常为3～5％)，各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH 值较低(通常pH = 6.8)，用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。

 

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统，即只有分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统，不连续系统中最典型、国内外均广泛使用的是著名的Ornstein-Davis 高pH 碱性不连续系统，其浓缩胶丙烯酰胺浓度为4％，pH = 6.8，分离胶的丙烯酰胺浓度为12.5％，pH =8.8。电极缓冲液的pH = 8.3，用Tris、SDS 和甘氨酸配制。配胶的缓冲液用Tris、SDS 和HCl 配制。

    样品在电泳过程中首先通过浓缩胶，在进入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，CL－、甘氨酸阴离子以及蛋白质－SDS 复合物，在浓缩胶的pH 值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而CL－的电泳迁移率最大。在电场的作用下，CL－最初的迁移速度最快，这样在CL－后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此CL－后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，CL－和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质－SDS 复合物由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl－的界面附近而被浓缩成很窄的区带(可以被浓缩三百倍)，所以在浓缩胶中CL－是快离子(前导离子)，甘氨酸是慢离子(尾随离子)。当甘氨酸到达分离胶后，由于分离胶的pH 值(通常pH = 8.8)较大，甘氨酸离解度加大，电泳迁移速度变大超过蛋白质－SDS 复合物，甘氨酸和Cl－的界面很快超过蛋白质－SDS 复合物。这时蛋白质－SDS 复合物在分离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳，向正极移动。由于蛋白质－SDS 复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子，可以自由通过凝胶孔径，所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝胶底部时，停止电泳，从平板中取出凝胶。在适当的染色液中(如通常使用的考马斯亮蓝)染色几个小时，而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中未与蛋白结合的背底染料，这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋白质区带。通常凝胶制备需要1～1.5小时，电泳在25～30mA 下通常需要3小时，染色2～3小时，过夜脱色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳。Ornstein 和Davis 设计的高pH 碱性不连续系统，有其独特的特点。根据Henderson-Hasselbalch公式：pH=pKa + lg([Base]/[Acid])

式中的“α”是缓冲液中各种分子的离解度。由上式可以看出：①浓缩胶的pH(6.8)小于慢离子甘氨酸的pKa(9.8)3个pH 左右，所以 α≈ 0.001，即在浓缩胶中甘氨酸只有0.1％离解，因此在电场中迁移很慢，是慢离子;②快离子Cl－由于几乎全部离解，电泳迁移率最大，不受pH 变化的影响;③分离胶的pH(8.8)小于慢离子的pKa 一个pH 左右，α≈ 0.1，所以在分离胶中甘氨酸离解加大，电泳迁移率加大，就赶到蛋白质带的前面。
    此外还可以总结出该系统的特点有：电极缓冲液中共轭碱Tris 的pKa 小于分离胶的pH 约１个pH，使其缓冲能力大。电极缓冲液的pH 为8.3，相近于Tris 的pKa(8.1)，以便获得最大的缓冲能力。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳还可以用于未知蛋白分子量的测定，在同一凝胶上对一系列已知分子量的标准蛋白及未知蛋白进行电泳，测定各个的标准蛋白的电泳距离(或迁移率)，并对各自分子量的对数(log Mr)作图，即得到标准曲线。测定未知蛋白质的电泳距离(或迁移率)，通过标准曲线就可以求出未知蛋白的分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS 电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。

 

 

SDS-PAGE胶制备

一. 实验原理：
SDS-PAGE是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。
SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。
二. 试剂和器材：
试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50％甘油，2ml 10％的SDS，0.5ml巯基乙醇，1ml 1％溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃保存数周，或在－20℃保存数月。
2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。
3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。
4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。
5. TEMED（四乙基乙二胺）原液
6.10％过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制）
7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。
8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70％的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。
器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。

三. 实验操作；
（一）样品制备
将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热5－10min，取上清点样。
（二）分离胶及浓缩胶的制备

1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH₂O冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干；
2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板；
3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀；
ddH₂O 3.0 ml
1.0 mol/LTris-HCl pH=8.8 2.1 ml
30％ Acr-Bis 2.8 ml
10％ SDS 80 ul
10％AP 56 ul
TEMED 6 ul
4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合；
5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH₂O 1.0 mol/LTris-HClpH=6.8 30％ Acr-Bis
2.0 ml 400 ul 600 ul
10％ SDS 10％ AP TEMED
36ul 24ul 4ul
6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳；
7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl;
8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr.
9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。

 

 

附：

DTT

DTT即DL-Dithiothreitol，中文名为二硫苏糖醇。分子式为C₄H₁₀O₂S₂，分子量为154.25，纯度>99%。

　　常用还原剂，有抗氧化作用，进口分装。DTT和巯基乙醇相比，作用相似，但DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多。而且DTT比巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，但DTT价格略高一些。

还原性

　　DTT是一种很强的还原剂，其还原性很大程度上是由于其氧化状态六元环（含二硫键）的构象稳定性。它的氧化还原电势在pH为7时为-0.33伏。

应用

　　DTT的用途之一是作为巯基化DNA的还原剂和去保护剂。巯基化DNA末端硫原子在溶液中趋向于形成二聚体，特别是在存在氧气的情况下。这种二聚化大大降低了一些偶联反应实验（如DNA在生物感应器中的固定）的效率；而在DNA溶液中加入DTT，反应一段时间后除去，就可以降低DNA的二聚化。

　　DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。但DTT往往无法还原包埋于蛋白质结构内部（溶剂不可及）的二硫键，这类二硫键的还原常常需要先将蛋白质变性（高温加热或加入变性剂，如6M 盐酸胍、8M 尿素或1% SDS）。反之，根据DTT存在情况下，二硫键还原速度的不同，可以判断其包埋程度的深浅。

特点

　　由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；而Tris(2-carboxyethyl)phosphine HCl（TCEP盐酸盐）可以作为低pH值条件下DTT的替代品，而且也比DTT更为稳定。

　　1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液

　　【配制方法】用20ml 0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09g DTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。

　　【注意】DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

　　DTT：Deloitte Touche Tohmatsu 德勤全球，即德勤会计事务所的上级公司。