植物组织培养过程中的脱毒与病毒检测

植物组织培养过程中的脱毒与病毒检测

 

 一、病毒与危害 第一种类型为曾经或正在大面积或高比率发生，并造成严重为害的植原体病害，主要包括枣疯病和泡桐丛枝 病。 第二类型为局部或零星发生病害类型， 山楂丛枝病严重地区约占20%左右。 桃树黄化病和红叶病的发生面积较大， 第三种类型为国内外引种或国内苗木调运而传入病害类型，比较典型的为从以色列引进的樱桃扁枝病和黄化病。1995年北京中以示范农场从以色列引进一年生的经嫁接的6个欧洲樱桃品系的苗木3500株，栽植当年即发现患带化病苗木，1995～1996年度的发病率为3%。在从国内其它地区引入的樱桃、枣树、泡桐等新品种苗木上也都发现带病苗木。

       二、脱毒方法 植物的病毒除豆类等一部分作物外，种子均不传染病毒，而营养繁殖的植物病毒病的蔓延日益显著，几乎遍布所有所有这类植物。病毒的粒子极其微小，只有在电子显微镜下才能确定，防治极其困难。自50年代发现用组织培养可以脱除病毒以来，现已在生产上广泛应用。

       [一]茎尖脱毒 原理：感染病毒植株体内的病毒分布并不均匀，病毒的数量随植株的年龄与部位而异，越靠近茎顶端区域的病毒的浓度也越低，分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞的不断分裂和活跃的生长速度，所以生长点含有的病毒数量极其微少，几乎检测不出病毒，因此剪切的茎尖愈小愈佳，但太小时不易成活，过大则不能保证完全除去病毒，不同种类植物和不同种类病毒在茎尖培养时切取的茎尖大小也不相同。 方法：在解剖镜下，一手用镊子夹住无菌的茎尖，一手用锋利的无菌刀逐层剥去生长点周围的叶片，直到达到晶莹发亮的光滑圆顶为止，根据不同目的可取带2-3个叶原基的茎尖或大一点的带2-3片幼叶的茎尖。到底多大的生长点才合适，当然越小越好，比如用0.1毫米以下的生长点，去病毒的效果就较好，但成活率低并且由于体积太小，常常使得培养时间延长到一年，甚至会更长，这不但历时过长而且也增加了转换培养基时材料污染的机会。一般说来，根据病毒种类不同切取约0.1-1毫米大小的生长点就可以去掉病毒。大部分都是切取0.2-0.5毫米带1-2个叶原基的茎尖为培养材料。

       [二]高温脱毒 原理：植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。但每种植物都有其临界温度范围，超过这一临界范围或在此范围内处理时间过长，都会导致寄主植物组织受伤。为此可使用变温的处理方法，高（40℃）和低温（16-20℃）交替处理，既能保证植物材料不受伤害，又能除去病毒。 (1)温汤浸渍处理：适用于休眠器官、剪下的接穗或种植的材料，在50℃左右的温水中浸渍数分至数小时，方法简便易行但易致使材料受伤。 (2)热风处理：将生长的盆栽植株移入温热治疗（箱）室内，处理温度和时间因植物种类和器官的生理条件而异，一般在35-40℃，短则几十分中长可达数月。

       [三]低温脱毒 原理：亦称冷疗法，菊花植株在5℃下，经4-7.5个月处理后，切取茎尖进行离体培养，可以有效去除菊花矮化病毒与菊花褪绿斑驳病毒，仅茎尖培养则无此效果，目前低温脱毒的报道尚少，但不失为一种脱毒的方法。 [四]化学疗法脱毒 原理：许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）在植物体内和植物叶片内，进行其抑制病毒的增殖或使之不活化的测定，在某种程度上抑制了病毒的增值或不活化。整株植物用化学疗法不能除去病毒，但离体培养和原质体培养效果明显。

       [五]愈伤培养脱毒 原理：从感染组织诱发的愈伤组织，不是所有的细胞都带有病毒，感染愈伤组织分化出的无病毒植株，也证明一些愈伤组织细胞实际上并不含有病毒。原因是病毒复制与细胞增殖不同步；同时发生变异的一些细胞获得对病毒感染的抗性，抗性细胞与敏感细胞共同存在于母体组织之中，由此分化出的植株也就有部分是无病毒植株。

       [六]珠心胚培养 原理：具有多胚性的种子（如柑桔）除了一个有性胚之外，其他的胚是来源于不含病毒的珠心细胞。通过培养珠心胚，可以得到除去病毒的新生系，然后嫁接繁殖成无病毒植株。

       [七]花药脱毒 原理：果树多为无性繁殖，长期种植后病毒积累较多，病毒病危害严重，花药培养也是一个很好的途径，目前已草莓上广泛使用，脱毒率在 90% 以上 。

       [八]综合脱毒法 1。选择无或少病毒植株 2。接种去分化长愈伤组织 3。快繁苗木 4。高温+茎尖处理 5。重复处理2-3次 6。鉴定有无病毒 7。生产应用 三、病毒检测 1、直观测定法 直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状特征是一种最简便的方法。然而在寄主植物上感染病毒后出现症状需要较长时间，还有的不使寄主植物表现可见症状，因此需要更敏感的测定方法。 2、指示植物法 利用病毒在其他植物上出现的病毒特征作为鉴别病毒种类的标准，这种专用易产生病毒症状特征的寄主即为指示植物，又称鉴别寄主。症状分两种类型，一种是接种后产生系统的症状，并扩张到非接种的部位；一种是只在接种部位产生局部病斑，根据病毒的类型而出现坏死、退绿或环状病斑。指示植物有荆芥、千日红、昆诺阿藜和各种烟草。 3、抗血清鉴定法 植物病毒是由核酸与蛋白质组成的核蛋白，可作为一种抗原，注射到动物体内即产生抗体。抗体存在于血清之中称为抗血清。不同病毒产生的抗血清都有各自的特异性，用已知病毒的抗血清来鉴定未知病毒，这种抗血清就成为高度专一性的试剂，特异性高，是目前快速定量测定病毒的常规诊断。 4、酶联免疫法（见图） 5、电子显微镜观察法（见图） 6、PCR检测法