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1 植物病毒的危害 自第一个植物病毒——烟草花叶病毒(Tobac comosaic virus)发现至今，发现的植物病毒的种类已达近千种。病毒侵染植物后，不仅破坏细胞的代谢活动，引起植物的病理变化，而且影响植物的生长和发育，降低作物的产量和质量，甚至使植物死亡。植物病毒可通过叶液、种子、介体、士几壤等各种途径传播，对粮、油、果、菜、花、本等经济作物具有很大的危害性。植物病毒分布广，繁殖速度快，防治困难，因此有植物“癌症”之称。随着生态环境的恶化和植物种质的不断引进，病毒种类不断增多，危害有加重趋势。据统计，全世界每年由植物病毒造成的经济损失约400亿美元。我国是个农业人国，植物病毒病发生较严重，造成巨大损失。因此，加强对植物病毒的研究，寻找有效的防治措施，是当前和今后一个重点和难点。而通过一些技术手段，脱除植物所带病毒是解决营养繁殖植物病毒危害的途径之一，由于具有重大的应用价值，多种脱除植物病毒的技术相继发展起来，成为植物生物技术中最成功的范例之一。 2 病毒脱除理论依据 病毒属于非细胞生物，其繁殖和生存寄生于其它生物细胞中，因而严格的说任何药剂都不能完全解除其危害。为了摆脱病毒的危害，进行了不断的研究探索。White(1934)发现病毒在根系内是不均匀分布的，越靠近根尖部分病毒越少。Limasset(1949)在芽的分生组织区段也发现病毒分布的不均匀性。病毒在患病植株上的分布是不均匀的，在老叶及成熟的组织和器官中含量较高，在幼嫩叶及未成熟的组织和器官中含量低。这两项发现为茎尖脱毒提供了理论基础，1952年Morel首先利用茎尖分生组织培养获得了大丽菊无病毒植株。此后相继有马铃薯、菊花、兰花、百合、草莓、莺尾等茎尖培养脱毒研究成功的报道并对病毒的脱出理论进行了诸多研究。 2.1 病毒在植物体内分布不均匀性假说 关于病毒在植物体内分布不均匀性主要有以下五种假说: 能量竞争:病毒核酸和植物细胞分裂时DNA合成均需要大量的能量，而分生组织细胞本身很活跃，其DNA合成是自我提供能量自我复制，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量来完成自我复制，因此就得不到足够的能量，从而就抑制了病毒核酸的复制。 传导抑制:病毒在植物体内的传播主要是通过维管束来传播的，但在分生组织中，维管束组织还不健全，从而抑制了病毒向分生组织运输。 激素假说:在分生组织中，生长素和细胞分裂素水平均很高，因此阻止了病毒的侵入或者抑制病毒核酸的合成。 酶缺乏:病毒的合成可能需要的酶系统在分生组织中缺乏或还没建立，因而病毒无法在分生组织中复制(stache-smith，1968) 抑制因子:认为在分生组织中存在有某种抑制因子。 2.2 病毒传播途径 关于病毒的传播途径和方式有较多的报道，其自然传播途径有接触传播，如感病植株与健康植株的接触、机械传播、嫁接传播等；有通过某种特定方式与相结合的有机体进行传播，如蚜虫、真菌、线虫、叶蝉、嫡类、蓟马、甲虫等:有通过植株的繁殖部分传播，如种子、薯块、花粉等二种途径。所有病毒都可通过鳞(块)茎和嫁接传病。大多数病毒可汁液传染，但PLRV等不能汁传，而是借助蚜虫，获得病毒后可终生带毒。 2.3病毒扩散与积累 关于病毒的增殖、运输、积累及传播途径机制研究表明:许多植物病毒从最初侵染的细胞移动到相邻的健康细胞到达维管束系统之后，能随着光同化作用被动地进行系统的长距离运输，引起系统侵染。植物病毒细胞到细胞的短距离运动是一个主动过程，其运动由病毒所编码的非结构蛋白一运动蛋白所介导。运动蛋白与病毒核酸和胞间连扮相互作用，改变胞间连丝允许通过的最大孔径(size exclusion limit，SEL)，增加其渗透性，使得病毒核酸以病毒粒子或核糖核蛋白(RNP)的形式通过胞间连扮到达相邻的健康的细胞。运动蛋白介导植物病毒细胞到细胞运动的确切机制尚在探讨之中(郑文光，2003)。病毒的侵染形式是通过筛管汁液流的转运而扩散至植物体各部，病毒最终的位置依赖于初始侵入的叶片的位置，通常植株下部叶片的病毒可转运至根部，而上部叶片的病毒常转运至茎尖。病毒的分布常在库组织，在PVX的研究中己得到很好的证明(马丰山，2001)。对马铃薯PVX和PVY病毒在侵染及运转速度的研究表明:接种7天后病毒开始运转，17天后(Y病毒为14天)所有被检测的植株甸甸茎和块茎中都发现了较高的病毒含量，其次是心叶(包括生长点)和接种叶片。病毒含量的高低与接种时植株大小密切相关，植株越小，其各器官中的病毒含量越高。病毒运转部位主要是生长速度快的甸甸茎、块茎和心叶及生长点。而随植株的增大，病毒达到块茎所需要的时间越长，且春季接种病毒的各部位的病毒含量均比秋季接种的高(王培伦，1999)。长期继代培养的试管苗有可能再次染上病毒，马铃薯试管苗在继代培养两年后，均发现有不同程冷的病毒和细菌再停染，只有通过再次草尖脱毒才能平新复壮(王军，1992)。杨元军等(2002)对马铃薯两个品种组培苗的顶部、中上部、中下部和基部茎段的继代繁殖试管苗用DAS一ELISA法进行PVX和PVY病毒检测时发现，各茎继代繁殖的试管苗的病毒含量无显著差异。综上所述，植物体内本身携带病毒或感染病毒后，其病毒在体内可以进一步繁殖和侵染。病毒在体内的分布不是均匀的，可以依据病毒本身生物学特性以及在植物体内分布的不均匀性，配合物理、化学方法是可能脱除病毒而获得无病毒植株的。 2.4 脱毒机理 病毒的遗传物质是核酸，进入植物细胞后，随其一起复制，侵染形式是通过筛管汁液流的转运而扩散至植物体各部，引起系统侵染(郑文光，2006)植株细胞分裂和病毒繁殖之间存在着竞争关系。在受侵染的植株中，顶端分生组织无毒或含毒量极低，较老组织的含毒量随着与茎尖距离的加大而逐渐增加。分生组织含毒量低的原因可能是：一、在茎尖中存在高水平生长素，可抑制病毒的增值。二、在旺盛分裂的细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制。三、在植物体内可能存在着病毒钝化系统，它在分生组织中比其他任何区域具有更高的活性。四、植物病毒自身不具有主动转移的能力，无论在田间病植株间还是在病组织内，病毒的移动都是被动的。在植物体内，病毒可以通过维管束组织系统长距离转移，转移的速度较快，而分生组织中不存在维管束。病毒也可通过胞间连丝在细胞间转移，但速度很慢，难以追上活跃生长的茎尖。(姜春华，2006)。病毒在植株体内的分布是不均匀的，在茎尖中呈梯度分布。在旺盛分裂的细胞中植物核蛋白合成占优势，在细胞伸长生长期间病毒核蛋白合成占优势，利用这一原理，加速分生组织细胞的分裂能够获得无病毒植株。Limasset(1949)等进一步研究发现，由病毒感染的植株，不同部位病毒分布不一致。在老叶和成熟的组织及其器官中病毒含量较高；而幼嫩的及未成熟的组织和器官中病毒含量较低，在生长点约0.1mm-1.0mm区域，则几乎不含或含病毒很少。Morle(1952)根据病毒在寄主植物体内分布不均匀的特点，建立了茎尖培养脱毒方法，这种方法主要用于消除病毒以及类病毒、类菌质体、细菌和真菌等病原物(葛胜娟，2005)。 3 传统的植物脱毒方法及其特点 3.1 热处理法 热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，从而得到一小部分不含病毒的植物分生组织，进行无毒个体培育(张尊平，1996)。热处理并不能杀死病毒，只能钝化病毒的活性，使其在植物体内的增殖减缓或停止，从而失去侵染能力。热处理也可以加速植物细胞的分裂，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中获胜(姜春华，2006)。 热处理的设备一般比较简单，具有良好增温送风设备的温室或者光照培养箱、恒温水浴锅都可以。处理植物的成活率依季节而定。夏季为最适合的季节，冬季即使解决照明问题，高温下也容易形成弱苗，难以承受两周以上的高温热处理，春秋季比冬季效果要好，但也远不如夏季理想，因此要加强管理，注意高温驯化(胡琳，2000)。Bhardwaj(1998)等发现在热空气处理过程中，通常温度越高，时间越长，脱毒效果就越好，但是同时植物的生存率却呈下降趋势。采用变温处理，比恒温处理植株死亡率低脱毒效率高。热处理是不能脱除所有病毒。例如在侵染马铃薯的病毒之中，对于PLRV、PVA和PVY不进行高温预处理，脱毒率也相当高，而高温预处理却可以显著提高对队MV、PVX和PVS的去除。一般而言，对于球状病毒和类似纹状的病毒以及类菌质体所导致的病害才有效，对杆状和线状病毒的作用不大。 3.2 茎（根）尖培养脱毒法 茎尖培养脱毒的依据是:病毒在患病的植株上分布不均匀，在较老的器官和组织内病毒含量较高，在幼嫩的或未成熟的组织和器官中病毒含量较低，而茎尖是植株中最年轻，细胞分裂最活跃的部位;病毒一般通过维管束转移，茎尖分生组织没有维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞分裂和生长的速度，所以它几乎不含或很少含病毒。植物茎尖中无毒生长点培养，成了去除植物中病毒使植物复壮的重要方法。 茎（根）尖培养是切取茎（根）的先端部分或茎（根）尖分生组织部分进行的无菌培养。是以White(1934)和Limasset（1949）提出的病毒在植物体内分布不均一，植物顶端分生组织几乎没有病毒的原理为依据。严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.lmm。但这么小的茎尖实际上很难取得，培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，常采用带有叶原基的生长锥来培养。根尖也可以作为脱毒外植体（Jones，1968）。后来逐渐成为植物脱毒的主要方法。百合脱毒的外植体可以是田间生长的珠芽，也可以是鳞片组培获得的珠芽。一般采用0.2-0.4mm茎尖分生组织最为有效。在国外，从20世纪60年代起就开始利用百合茎尖脱毒获得无病毒植株，如PhiiliPs于1962年利用百合茎尖培养脱毒成功;采用茎尖脱毒技术生产出宜兴百合脱毒组培苗（席梦利，2001）。对带LSV、CMV、LMoV的铁炮百合Georgia进行茎尖脱毒，经4个月的继代培养后，脱除病毒（Kim，1996）。用百合脱毒鳞片培养再生籽球的生长点作为脱毒的原始材料，也是有效方法（Mori，1971）。植物通过茎（根）尖培养获得无病毒植株的难易程度与品种和感染病毒的种类有直接关系（Vanzaayen，1992）。同时，与病毒检测技术方法相关，早期均采用指示植物检测，灵敏度较低，许多并没有真正脱除。茎尖脱毒培养的2个关键技术环节是茎尖的成活率和脱毒率。茎尖培养成活率低，褐化是降低茎尖培养成活率的首要因素。褐化的发生与许多因素有关，茎尖大小、取材季节、培养方式、激素浓度、基木培养基、培养基添加物都对茎尖褐化有影响，例如茎尖越小，褐化越严重、成活率越低。 由于单独的热处理方法脱毒率低，而单独的茎尖培养对操作的要求较高，所以将二者结合可以提高植物的脱毒率，降低操作难度。植物生长的顶端是一段无毒区，热处理过程中，可使原植物生长点顶端免疫区得以扩大，使所取茎尖生长点大于未经热处理植株的生长点，以提高外植体培养成活率（王壮伟，2003）。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。席梦利（2001）利用38±1℃，6h或25℃8h热空气和50±1℃，40min恒温水浴结合茎尖培养脱除了宜兴百合的CMV病毒。Thomson（1956）将感染X、Y病毒的马铃薯放在暗处发芽，当芽长到1-2cm时用35℃处理7-28d后，取5mm的茎尖培养而获得了无毒植株。宋瑞林（1999）利用此方法脱除了切花菊的番茄不育病毒。这2种脱毒方法各有利弊，由于各种病毒钝化的温度不同，某一温度的热处理不能排除所有病毒。将热处理和茎尖分生组织培养结合起来就可取更长的茎尖，这样可大大提高茎尖分生组织培养的成活率，而对脱毒效果没有太大的影响。 3.4 抗病毒药剂法 抗病毒药剂作用方式主要有以下四种：1）与病毒竞争细胞表面的受体，阻止病毒的吸附。2）阻碍病毒穿入脱壳，如金刚烷胺能抑制流感病毒的脱壳而预防流感。3）阻碍病毒生物合成，如疱疹净抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，影响DNA的合成；核糖腺苷，核糖胞苷干扰DNA聚合酶，阻碍DNA的合成；吗啉双胍对病毒增殖周期各个阶段几乎均有抑制作用（主要是阻抑RNA聚合酶的活性及蛋白质的合成）。此外，某些药物可被由病毒基因编码的酶（如胸苷激酶）磷酸化，该磷酸化合物为病毒DNA聚合酶的底物，二者结合后就可发挥抑制酶的作用，因而可阻止病毒DNA的合成，如阿昔洛韦。4）增强宿主抗病能力的物质，如干扰素能激活宿主细胞的某些酶，降解病毒的RNA，抑制蛋白的合成，翻译和装配。这种方法一般要与茎尖培养相结合应用。 采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱毒方法，可以较容易的脱除多种病毒，经过抗病毒药剂处理的嫩茎，切取茎尖，再进行组织培养，会提高脱毒率和成活率。而且这种方法对取材要求不严，接种茎尖可大于1mm，易于分化出苗，提高存活率。化学疗法在百合脱毒上的应用效果，已在鳞片培养和愈伤组织培养试验中得到肯定。抗病毒剂使用浓度越高，处理时间越长脱毒效果越加明显。相反，高浓度抗病毒剂对植株的生长有一定伤害。 3.5 愈伤组织培养脱毒 通过植物器官或组织的培养来诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化出芽长成植株而获得无毒苗。利用这种方法先后在百合、甘蔗、马铃薯、天竺葵、大蒜和草莓等多种植物上获得成功。其原理是愈伤组织的某些细胞不带病毒，这是由于病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度，或者是有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。方法是通过花卉各种器官或组织诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再诱导分化产生芽，长成小植株，可以得到无病毒苗。刘文萍等人用唐葛蒲花蕾进行离体培养，可脱除烟草花叶病毒，脱毒率为60%。这种方法的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株，并目一些植物的愈伤组织尚不能产生再生植株。 3.6 其他脱毒方法 除了以上这些脱毒方法，花药培养法、花芽培养、胚珠培养法和茎（根）尖徽体嫁接等也可用于植物脱毒。单一的脱毒处理技术一般难以完全脱除病毒或需要较长的时间，多种脱毒技术的组合使用逐渐成为生产无毒百合种苗的首选。Blom-Barnhoorn（1985）采用茎尖脱毒+40 mM病毒唑处理的方法将百合品种Arai带毒率从61%降为35%。徐品三（1999）对鳞片在35℃下处理4周后在含5mg/L（毫克/升）病毒唑的培养基中诱导珠芽，最终70%的‘Georgia’和94%‘Casablanca’珠芽病毒检测呈阴性。 4 低温脱毒疗法 低温疗法是基于超低温保存对细胞的选择性破坏作用的原理，结合组织培养和病毒检测技术达到脱毒的目的。超低温保存是指在-80摄氏度以下的超低温条件下保存种质资源的一整套生物技术。现在常用液氮做冷源，超低温保存的原理是在超低温条件下，细胞的全部代谢活动近乎完全停止，人大减慢甚至终比代谢和衰老过程，保持生物材料的稳定性，减少遗传变异的发生，达到一长期保存的目的。茎尖分生组织的分化程度小，再生相对容易等优点，被认为是较为理想的种质超低温保存材料。至今己对近200多种植物材料的茎尖成功的进行了超低温保存。作为一种新的脱除植物病毒的方法，已成功的用于几种植物病毒的脱除，低温疗法以其相对简单的操作方法和高脱毒率将为植物病毒的脱除带来新的希望。超低温保存与茎尖培养相结合是植物脱毒和保存茎尖的一种新方法。分化的、含有病毒的植物细胞液泡较大，液泡中含有的水分也较多，在超低温保存过程中易被形成的冰晶破坏致死，而增殖速度较快的分生组织中液泡较小或不含液泡，因而含水量相对较少，胞质浓，抗冻性强，不宜被冻死。光学显微镜观察显示液氮中的超低温能杀死含较大液泡的细胞，而保存液泡小的顶端分生组织细胞。这样超低温处理过的植株再生后大多是无病毒的。 低温疗法脱除植物病毒不但避免了传统的茎尖培养脱毒中在显微镜下切取茎尖过程的操作困难，免除了在切取分生组织时由于操作时间过长和多酚的氧化而导致的茎尖黑化问题，而且脱毒率高，具有传统方法无可比拟的优点。研究表明，对茎尖进行超低温保存是脱除植物病毒的一种简单、快速而有效的方法，是植物脱毒的一种新途径。另外，该技术还可以使植物脱毒与种质保存相结合，实现脱毒原种的长期保存。随着理论和技术的不断发展和完善，低温疗法在植物病毒防治方面有可能会发挥重要作用。 4.3 超低温保存技术 超低温保存技术根据冷冻-脱水方法的不同分为逐步冰冻法、脱水干燥法、包埋-脱水法、玻璃化法、包埋-玻璃化法、微滴-玻璃化法6种方法，其中应用最为普遍的是玻璃化法超低温保存。 4.3.1 玻璃化法 玻璃化（Vitrification）即将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使细胞及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下过冷到玻璃化转变温度（Glassy transition temepreture，Tg），从而被固化成玻璃化态（非晶态），并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法超低温保存是Luyet于1937年首次提出的，之后经过长期的理论和实践探索，于20世纪80年代才发展起来。自1968年Ralph利用玻璃化法超低温保存亚麻悬浮细胞以来，1989年Langis和Uragami et al.相继证实了油菜和芦笋玻璃化冻存植物材料同样是可行的。Schnabel-Preikstas et al.(1992)首先介绍了甘薯的低温保存应用，切取1mm的芽尖包换顶端生长点中的两个叶原基，在0.4M的蔗糖中预培养，接着在玻璃化溶液中脱水，玻璃化溶液是在MS培养基中加入50%(w/v EG)乙烯乙二醇,15%(w/v)sorbitol山梨醇和6%(w/v)BSA牛血清蛋白。然后放入液氮中低温保存。低温保存的茎尖细胞在含有1.5M的山梨醇的MS培养基中解冻，在含有生长素和激动素的固体MS培养基中后续培养用于恢复。结果：有71%的茎尖细胞经过液氮保存后存活，但是大部分茎尖形成愈伤组织后没有再生长，只有23%的存活茎尖在生长出新茎。与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法以其要求设备简单、材料处理步骤简便、省时省力、效果和重复性好等优点倍受人们推崇，成为较为理想的植物种质资源保存方法，并且在复杂的组织和器官的超低温保存方面有较好的应用潜力，是目前研究者多采用的超低温保存方法。玻璃化法超低温保存解决了茎尖或分生组织传统方法中只有一部分材料成活的技术问题。 4.3.2 微滴玻璃化 微滴玻璃化过程中，材料在渗透剂中预培养，用装载溶液装载材料，用玻璃化溶液PVS2脱水，在铝箔上分别加入4-15微升小滴的PVS2，PVS2是包含30%(w/v)glycerol甘油,15%(w/v)乙烯乙二醇,15%(w/v)DMSO 0.4 M蔗糖的MS培养基，然后直接放入液氮中。装有低温保存过的材料直接放入富含蔗糖的液体培养基中进行解冻和卸载，再用后续培养基培养培养茎尖用于存活和再生。Towill and Jarret(1992)对甘薯茎尖的微滴玻璃化研究中，从体外8-12周的植物腋芽上切取0.5-0.7mm的茎尖包含3-4个叶原基。用上述的方法处理后，两个不同的基因型获得了91%和26%的存活率吗、，但是再生率很低。存活的茎尖先形成愈伤组织，在从中心部分生长出新茎，但是不是所有的存活的茎尖都不能从愈伤组织中生出新茎。Pennycooke and Towill(2000)改进实验过程：从体外4-8周经过8小时黑暗处理的植物上切取0.5-1mm的茎尖包含2-3个叶原基，在0.3M蔗糖中预培养，在包含2M甘油和0.4M蔗糖的MS培养基装载溶液中装载，在22℃的PVS2的玻璃化溶液中脱水，把含有一个茎尖10微升的PVS2的微滴放在40×2大小的铝箔上。先放入-208℃液氮泥中15-30分钟，再放入液氮中。被低温保存的茎尖在包含1.2M蔗糖的液态MS培养基解冻20分钟，保持22℃的环境条件。然后在包含0.2mg/l NAA,1.1 mg/l BA 0.2 mg/l mg kinetin MS培养基中后续培养茎的再生。实验结果：66%的茎尖经过低温保存后存活，所有的存活的茎尖再生出新茎，形成非常小的愈伤组织，而且新茎是可以再生的。微滴玻璃化得主要优点在于，他通过铝箔上极小微滴的体积建立一个高的冷却、升温速率，有非常高的再生率，能够广泛的应用到各种不同的植物组织。这个方法是低温保存马铃薯的最理想的方法，更多的研究需要测试这个方法多其他基因型的应用性。 4.3.3 包埋脱水 包埋脱水也是玻璃化的基本方法，用这个技术可生产人工种子。由于脱水型较高的外植体中大部分或者全部的结晶水从细胞中移除，玻璃化的溶液在液氮中迅速结晶，避免了水结成冰的损伤。这步骤需要将材料用2-3%藻酸钠溶液包埋，来增加材料在脱水和低温过程的忍耐力，然后用热蒸汽或者硅胶脱水。脱水的材料组织直接放入液氮中。低温保存可以选择慢速解冻和在35-38℃的条件快速解冻，然后在后续培养基上培养存活再生。Pennycooke and Towill(2001)对甘薯茎尖的研究中：从离体4-8周的植物茎的顶芽上切取0.5-1mm长的茎尖包含2-3个叶原基，包埋在直径4-5mm的小珠内。将其逐步在液态的MS培养基内预培养，培养内的蔗糖逐步增加分别为0.25M、0.5M、0.75M分别培养一天的时间。然后用热空气脱水减少18.1%的水分浓度，脱水后直接放入液氮泥中15-30分钟，再转移至液氮中。低温保存过的包含茎尖的小珠在30℃液态的含0.06M蔗糖的MS培养基中解冻5秒钟，转移至不含铵根离子的含有0.2mg/l NAA,0.1mg/lBA,0.2mg/l kinetin和0.09 Msucrose的固体MS培养基中后续培养。前两天在黑暗中培养，茎尖从小珠中提取出来，再用同样的培养基在光下培养3天，最后把茎尖转移至标准的MS培养基中培养再生。结果：67%的低温保存过的茎尖再生出新茎。这个技术便于操作，可以处理大量相似的实验样本，结果通常有高的存活率，新茎嫩迅速直接从低温保存的茎尖再生出来。更重要的是，至用蔗糖作为冷冻保护剂，避免了像DMOS这些冷冻保护剂的毒害作用。唯一的不足是，在脱水阶段时间消耗较长。 4.3.4 包埋玻璃化 包埋玻璃化处理中，藻酸包埋的材料茎尖在富含蔗糖的培养基中预培养，在装载溶液中装载，然后用玻璃化溶液脱水，再直接放入液氮中。低温保存的茎尖解冻后，用卸载溶液移除玻璃化溶液，在后续培养基中培养再生。Hirai and Sakai(2003)对甘薯茎尖的研究中：先是将8mm长的节间在包含0.09 Msucrose,1g/lcasamino acids,0.5mg/lBA的MS培养基中培养，在25度持续16小时的光周期条件下。经过10-14天的培养，从顶芽上切取1mm长的茎尖包含3-4个叶原基，包埋在直径4mm的小珠内。在包含0.09 Msucrose and 1g/lcasamino acid的液态MS培养基中培养，在90 rpm的旋转器上25度得条件下培养24小时。再转移至包含0.3M蔗糖的液态MS培养基中预培养16小时。预培养的茎尖用包含2Mglycerol and 1.6 Msucrose的液态MS培养基装载，在60rpm的旋转器上25摄氏度下持续3小时。用PVS2脱水60分钟，在旋转器上60rpm25℃的条件下。然后直接放入液氮中。低温保存的茎尖在38℃的条件下解冻2分钟，用1.2M蔗糖溶液卸载20分在25℃的条件下，放在包含0.5 mg/l BA、1mg/l GA3的MS培养基培养7天，再转移至包含1 mg/l GA3不含BA的MS培养基中培养。在21天的后续培养中正常的茎再生，没有形成愈伤组织。平均的茎的再生速率超过了80%。这个技术避免了包埋脱水的长时间脱水，是最有希望的应用方法。 4.4 冷冻疗法脱毒 4.4.1 冷冻疗法的脱毒机理 冷冻疗法脱毒是结合低温保存技术和组织培养技术发展形成的新型脱毒技术。茎尖用于微繁殖的都是顶端或茎的分裂组织，包含3-4个叶原基，尺寸在1-1.5mm之间，新生的分生细胞通常没有病原体，如病毒植原体细菌。在底层的有大液泡的细胞更容易被病毒感染，在液氮冷冻处理阶段，这些细胞都被杀死，顶层的细胞没形成较大的液泡，细胞液浓的细胞如AD、LP1、LP2不易被感染在冷冻处理中存活下来，应用包埋脱水法和玻璃化法处理可以避免形成冰晶损坏细胞，结合组织培养技术将低温处理的材料细胞培养成植株，因此，经过冷冻处理再生的植株是无毒的。 4.4.2 冷冻疗法脱毒的特点： 与传统的热疗法和组织培养脱毒法相比，用传统的组织培养的脱毒方法面临着培养极小的组织的困难，培养材料的尺寸影响着存活率和再生的脱毒率，操作非常麻烦，不能用于大量的样本的生产。由于冷冻法脱毒不依赖茎尖的尺寸大小，操作非常容易简单，可以用于大量的样本生产，冷冻疗法脱毒的存活率和再生率相比较低，但是其脱毒率非常高。与传统的组培方法比，冷冻法用更少的再生茎尖去鉴定脱毒效果鉴定。低温方法效用性高，不需要特别的设备，液氮产生的低温条件实验成本低廉，便于处理大量的实验样品，主要得限制条件是不同的基因型需要不同低温处理协定，需要更多的研究扩大应用范围。 冷冻疗法脱毒的现况在1997年,Brison首次说明低温不存不仅可以保存种质资源还可以用于脱毒，经低温处理的李树的茎尖脱去了50% PPV病毒。(Brisonetal.l997).前不久，低温疗法脱毒可从块根块茎类作物茎尖脱去7种不相关的病原体，比如马铃薯、甘薯;果树里可应用低温脱毒的种类包括：柑橘、蔷薇科,浆果类、香蕉。对甘薯的两种病毒SPFMV和SPCSV的脱毒研究，从幼茎上取1cm长的节间，表面消毒杀菌后，外植体在包含2mg/l calciumpantho-tenate,200 mg/lascorbicacid,20mg/lputrescine,100mg/larginine,10mg/lcalciumnitrate0.09Msucrose的MS培养基中培养，经过3周的培养，从顶芽取1.0-1.5mm大小的茎尖包含3-4个叶原基，用包埋玻璃化的方法处理，再晶冷冻处理后，在后续培养中再生。解冻后的小珠在含0.5mg/lBP不含铵根离子的MS培养基中培养5-7天，存活的茎尖再转移到含5–10mg/lGA3和铵根离子的MS培养基中培养。结果：83-87%茎尖存活，87%的存活茎尖再生出新茎。经过TAS-ELISA和RT-PCR对两种病毒的鉴定，SPFMV和SPCSV脱毒率为100%。然而，同样材料的茎尖通过组培的方式脱毒，脱毒率仅为10%和7%。QiaochunWang（2003）对VitisviniferaL该种葡萄的GVA病毒的冷冻疗法的研究对植株的培养，在基础培养基（MS培养基包含3%sucrose和solidifiedwith 0.26% gellangum）培养16小时控制温度在24℃，每4个星期做一次次生培养。切取1mm长的茎尖，对其进行包埋脱水处理，0.1MCaCl2溶液其中包含2 Mglycerol and 0.4Msucrose在室温下处理30分钟形成小珠，每一个里面包含一个茎尖。在蔗糖浓度分别为0.250.50.751.0M的BM培养基里培养4天，一个梯度培养一天。在滤纸上用用热空气除水7小时，脱水之后放入液氮中处理1小时。为了鉴定不同梯度包埋脱水对脱毒的效果，包埋的小珠在不同的梯度条件下下再生长，产生的植株用于GVA的测试。切取1mm长的茎尖在不同蔗糖浓度的BM培养基中预培养，0.250.50.75M各1天，预培养的茎尖与2 Mglycerol0.75 Msucrose溶液培养60分钟温度在25度。之后用PVS2溶液玻璃化处理，在0度得条件下处理50分钟，然后转移至液氮中处理1小时。冷冻处理后的茎尖在40度得水浴条件下解冻，用1M蔗糖25℃的MS培养基冲洗，后续培养再黑暗的条件下24℃里保持2天，再转移至茎的培养基存活培养，6周之后长度超过3mm的转移的固体BM培养基培养再生完整植株。实验结果：在包埋预处理的过程中，茎尖的存活率是100%，脱水之后减少到82%，再经过液氮的冷冻，只有60%的茎尖存活下来。跟据对GVA的鉴定，在控制包埋预处理和脱水的处理中，没用清出GVA，在冷冻阶段清除了GVA，通过对比97%存活再生的植株没有GVA病原体。 4.4.3 冷冻疗法脱毒的难题与发展 目前应用中存在的技术难题：低温处理后的茎尖存活和再生率低，是低温保存和冷冻脱毒的应用难题，结合传统的组培方法研究培养基组成成分对材料的生长的促进与抑制作用，在改进预培养基和后续培养基的成分是未来工作研究的重点，在玻璃化脱水处理中减少冷冻保护剂的毒害最用能提高茎尖的存活和再生率，对冷冻保护剂的研究也是未来研究的重点。对再生植株的基因鉴定及脱毒植株的病原体鉴定也是未来研究的重点。 5、几种超低温脱毒方法操作模式 5.1、玻璃化法走超低温脱毒操作模式（以马铃薯为例） 5.1.1、技术路线 建立马铃薯无菌苗扩繁体系—预培养茎尖—装载处理—玻璃化保护剂脱水处理—投入液氮——解冻后洗涤—恢复培养—脱毒检测 5.1.2、试验材料 5.1.2.1、植物材料： 釆用优质高产主栽品种，选取健壮马铃薯带芽茎段作为外植体，接种到MS+KT 0.04+IAA 0.5+GA 0.5+糖30g/L+琼脂7g/L培养基上，在温度25℃、光照1600～3000lx、光照时间为14h/d条件下培养，无菌苗毎3周进行一次继代培养，以扩繁后的无菌苗作为试验材料。 5.1.2.2、仪器设备 北京中科起源科技有限公司可提供一下仪器设备：超净工作台、高压灭菌锅、1.8ml冷冻管、恒温培养箱、恒温水浴箱、液氮罐、玻璃棒、胶头滴管、PH试纸、烧杯、量筒、酒精灯、封口膜、解剖镜、剪刀、镊子、分析天平、三角瓶、容量瓶、移液枪、无菌滤纸、记号笔、标签纸、数码相机等。 5.1.2.3、主要试剂 北京中科起源科技有限公司可提供一下试剂：蔗糖、琼脂、BA、NAA、GA3、IAA、KT、升汞、酒精、NaOH、甘油（Gly)、二甲基亚砜（DMSO)、乙二醇（EG)、液氮（LN）等。 5.1.3、试验方法 5.1.3.1、外植体建立： 采用健壮的马铃薯幼嫩茎段，洗净外表泥土，用自来水冲洗1h,在超净工作台上用75%酒精消毒5s,快速用无菌水冲洗二次，再用0.1%升汞溶液消毒8min,无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干茎段表面水分，截取长约1.5cm茎尖、茎段，接种到MS培养基上进行初代培养，30d后用于继代扩繁。 5.1.3.2、继代培养 选取无菌苗切取1cm左右茎段，接种到最佳继代培养上MS+KT 0.04+IAA 0.5+GA 0.5+糖30g/L+琼脂7g/L培养基上，在温度25℃、光照1600～3000lx、光照时间为14h/d条件下培养30d左右待用。第一次继代培养30d左右，之后继代20～25d。 5.1.3.3、建立马铃薯超低温保存体系： 选用继代三次马铃薯无菌苗置于4℃暗培养箱中低温锻炼1周待用。 5.1.3.3.2、预培养 选取继代4周左右生长健壮的马铃薯茎段10mm接种于附加不同蔗糖浓度的MS培养基为4℃暗培养箱中预培养，蔗糖浓度分别设6个处理（0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L、0.9mol/L、1.2mol/L），写好标签备用。 在无菌条件下，剥取长约2～3mm经过预培养后的茎尖，剥离后迅速转移到1.8ml的冷冻管中，毎管10个茎尖。将高压灭菌后的装载液吸入含有茎尖的冷冻管中，于室温处理一定时间，装载时间设置6个处理。装载液（LS)要求必须经过高压灭菌，并且PH严格控制在5.8，装载液组成为：2mol/L甘油+4mol/L蔗糖，写好标签备用。 5.1.3.3.4、玻璃化保护剂脱水 用灭菌?头滴管吸取玻璃化保护剂PVS2于装载后的冷冻管中，于0℃下处理不同时间（0min、20min、30min、40min、60min、80min）。PVS2组成为：MS液体培养基+30%（w/v)甘油（Gly)+15%(w/v)乙二醇（EG)+5%(w/v)二甲基亚砜（DMSO)+0.4mol/L蔗糖。高压灭菌PVS2溶液，PH5.8,写好标签备用。 5.1.3.3.5、液氮保存 将玻璃化液处理后的茎尖移去原液，换取新鲜的PVS2,将冷冻管密封好套上一根线迅速投入液氮罐中至少保存1h,冷冻时间设6个处理（1h、1d、7d、10d、14d、30d），写好标签备用。 5.1.3.3.6、解冻及洗涤 从液氮罐中取出冷冻管在40℃恒温水浴锅中快速化冻90s,用无菌胶头吸管快速除去冰冻保护液，用洗涤液洗涤2次，每次10min。洗涤液（MS液体培养基+1.2mol/L蔗糖）经过高温灭菌，PH5.8。 5.1.3.3.7、恢复培养 将洗涤过的茎尖转入再生培养基MS+BA3+NAA0.1+GA5+30g/L糖+琼脂7g/L暗培养5d后转入正常光照下培养，2周后统计成活率即有部分恢复绿色茎尖占全部茎尖数的百分比，4周后统计再生率即成活茎尖数占全部试验茎尖数的百分比。 5.2、小滴玻璃化法低温脱毒操作模式 5.2.1、技术路线 建立无性系—茎尖分生组织剥取—预培养—装载—玻璃化保护剂脱水处理—液氮保存—快速化冻—恢复培养—正常培养—痛毒检测 5.2.2、试验材料： 5.2.2.1、植物材料 芋头 5.2.2.2、仪器设备 北京中科起源科技有限公司可提供一下仪器设备：双目解剖镜、Mdcartney或1.8～2ml冷冻管、过滤灭菌器、滤纸、磁力搅拌器、一次性针管、5mm*20mm铝箔条若干、冰箱、冰盒、镊子、解剖刀、烧杯等。 5.2.2.3、主要试剂 北京中科起源科技有限公司可提供一下试剂：蔗糖、琼脂、BA、NAA、少GA3、IAA、KT、升汞、酒精、NaOH、甘油（Gly)、二甲基亚砜（DMSO)、乙二醇（EG)、液氮（LN）等。 5.2.3、试验方法 5.2.3.1、材料获得 选取继代2～3个月的外植体，在无菌条件下，用双目解剖镜剥取0.8～1mm茎尖，包含1～2个幼嫩叶原基的顶端分生组织及基部约1mm3的原组织。 5.2.3.2、预培养 将剥离的茎尖放入含有0.3mol/L蔗糖固体培养基中，正常培养条件下进行1d以上的培养。 5.2.3.3、Loading装载 预培养后的茎尖转移到McCartney瓶（也可以用1.8ml或2ml冷冻管）中，瓶内装有5ml已过滤灭菌的装载液（2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖+MS,PH5.8),在25℃室温下处理20min后，将茎尖转移到无菌滤纸上停留30s,吸除多余的裝载液。也有研究认为装载这一步可以删除，不影响冻存效果。 5.2.3.4、脱水处理 将材料在0℃下放入装有玻璃化液PVS2(30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4mol/L蔗糖+MS,PH5.8)的McCaytney瓶进行20～40min脱水处理，磁力搅拌器以60rpm进行混匀。利用无菌的一次性针管吸取5～8滴玻璃化液（每滴4～15ul)滴到已消毒的铝箔条上（5mm*20mm),将脱水后的茎尖转到铝箔条上的玻璃化液滴里，每滴约含5个茎尖。铝箔条在使用前5min左右置于冰盒中降温至0℃左右。 5.2.3.5、液氮保存 脱水处理后，用镊子将附有茎尖的铝箔条直接浸入液氮至液氮停止沸腾，然后迅速将其转入2ml装满液氮的冷冻管中至少保存1h以上 5.2.3.6、解冻及洗涤 用镊子从液氮中取出冷冻管中的铝箔条，室温下迅速浸入已灭菌的洗涤液（MS液体培养基+1.2mol/L蔗糖）中，洗涤15min,或将铝箔条先浸入用40℃温水预热过洗涤液约30s后转入新鲜洗涤液洗涤。 5.2.3.7、恢复培养 将洗涤后的茎尖先转到含0.3mol/L蔗糖的固体MS培养基上培养，培养基上方铺二层巳消毒的滤纸，进行恢复培养，室温下（25℃）暗培养一夜，尔后将茎尖转接到含0.1mol/L蔗糖固体MS培养基上于黑暗条件下培养5d后，转到弱光条件下培养10d.以后转入正常培养。 5.2.3.8、病毒检测 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 中科起源——开设组培学员培训服务，随到随学，包学会 组培一站式服务（组培室设计规划+仪器试剂耗材采购+技术操作+资深专家辅导......） |
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