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新型分子标记——SRAP与TRAP及其应用
转贴自：科技长廊 传统作物育种过程主要依赖于植株的表型选择（phenotypic selection），性状选择效果难以提高。遗传标记特别是基于DNA多态性的分子标记在作物遗传连锁图谱构建、重要性状基因标记定位与克隆、种质资源遗传多样性与系统发育分析、品种指纹图谱绘制及遗传纯度检测等方面广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecular marker-assisted selection, MAS)为育种工作提供了极大方便，可显著提高育种的选择效率与育种预见性。 1 现有的分子标记 目前分子标记技术主要有RFLP、RAPD、ISSR、 AFLP、 SSR、SCAR和单核苷酸多态性 (SNP)、表达序列标签 (EST)等。由于PCR技术的优点，基于PCR的标记体系类型多样，应用广泛，但各自的复杂性、可靠性与遗传信息不同。如RAPD方法简单、成本低，但重复性较差、检测位点不多；SSR多为共显性、重复性好，但位点较少、引物开发成本高；AFLP谱带多，但分析程序复杂、成本高，有时要用到同位素，而且甲基化敏感的限制酶由于基因组DNA的甲基化可导致“假多态性”产生，识别AATT位点的MseI酶常会引起一些物种基因组中标记分布不均衡；多数情况下，RAPD与AFLP标记测序需要克隆，增加了工作量。 2 SRAP标记体系分析原理与方法 相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism, SRAP)是一种新型的基于PCR的标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系Li与Quiros博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性（sequence-based amplified polymorphism，SBAP）。 2.1 SRAP标记引物设计原理 引物设计是SRAP分析的核心。SRAP标记分析共有两套引物。在一组正向SRAP引物中使用“CCGG”序列，其目的是使之特异结合可译框（ORFs）区域中的外显子。研究表明外显子一般处于富含GC区域，如拟南芥2和4号染色体的全序列中，外显子CG比例分别为46.5%和44.08%，而内含子中则为 32.1%和33.08 %；而且除着丝粒区域有较低基因密度外，基因几乎平均分布在这两个染色体上。从GenBank中随机选择20个BAC序列，发现约66%的CCGG序列位于这些克隆中的外显子内。据统计，拟南芥约1/3基因组外显子位于2、4号染色体上。运用CCGG序列就可特异扩增出包含这些组分的序列。 当然，由于外显子序列在不同个体中通常是保守的，这种低水平多态性限制了将它们做为标记的来源。由于内含子、启动子和间隔序列在不同物种甚至不同个体间变异很大，富含AT的区域序列通常见于启动子和内含子中，SRAP中使用的反向引物的3′ 端含有核心AATT，以特异结合富含AT区，这就使得有可能扩增出基于内含子与外显子的SRAP多态性标记。 2.2 引物设计与应用 引物大小和引物组合是成功进行SRAP分析的关键。SRAP-PCR反应体系中使用两个引物：17碱基正向引物（F-primer）和18碱基反向引物(R-primer)；早期反向引物在3’端选择性核苷前多一个C（19个）；使用同位素检测时引物可用33P-ATP标记。正向引物含有一段14碱基的核心序列（core sequence）：5′端前10个碱基为“填充”序列（filler sequence），无任何特异组成，接着为CCGG序列；随后为3′ 端的3个选择性碱基，选择性碱基的变化与相同核心序列组合成一套正向引物。反向引物的组成与正向引物类似，但“填充”序列后连接的为AATT；AATT序列后为3个选择性可变碱基，位于引物3′ 端。当然，构建正向与反向引物的总体要求是它们不形成发夹结构及其他二级结构，且CG含量为40%－50%，且两者“填充”序列在组成上必须不同，长度为10或11个碱基。 目前文献中报道的部分标准引物序列如下： 正向引物Forward primer 反向引物Reverse primer me1:5′TGAGTCCAAACCGGATA-3′ em1:5′GACTGCGTACGAATTAAT-3′ me2:5′TGAGTCCAAACCGGAGC-3′ em2: 5′GACTGCGTACGAATTTGC-3′ me3:5′TGAGTCCAAACCGGAAT-3′ em3: 5′GACTGCGTACGAATTGAC-3′
me4:5′TGAGTCCAAACCGGACC-3′ em4: 5′GACTGCGTACGAATTTGA-3′ me5:5′TGAGTCCAAACCGGAAG-3′ em5: 5′GACTGCGTACGAATTAAC-3′ me6:5′TGAGTCCAAACCGGTAA-3′ em6: 5′GACTGCGTACGAATTGCA-3′ me7:5′TGAGTCCAAACCGGTCC-3′ em7: 5′GACTGCGTACGAATTCAA-3′ me8:5′TGAGTCCAAACCGGTGC-3′ em8: 5′GACTGCGTACGAATTCTG-3′ em9: 5′GACTGCGTACGAATTCGA-3′ em10: 5′GACTGCGTACGAATTCAG-3′ em11: 5′GACTGCGTACGAATTCCA-3′ 实验表明，用单引物扩增只能扩增几条大约0.5~1kb的片段；使用较短引物，10碱基RAPD引物，以及含有SRAP引物核心序列的14－15碱基大小的引物，这些引物组合可得到多种扩增片段，但是扩增产物不稳定，特异性不强；20-22碱基引物放射自显影的结果背景太强；合适的引物大小在17－18碱基。 2.3 SRAP-PCR扩增 反应模板多数是基因组DNA，也可以是cDNA。在一个标准PCR反应体系中，0.2mmol/L dNTPs,1.5mmol/L Mgcl2,0.3µmol/L引物，1U Taq酶。SRAP-PCR反应采用复性变温法：开始94℃变性5min；反应前5个循环在94℃ 1min，35℃ 1 min，72℃ 1－2 min条件下运行；之后30－35个循环复性温度提高到50℃，最后延伸5~7 min。 前5个循环复性温度设为35℃ ，主要是考虑到低的复性温度能确保两个引物与靶DNA部分配对；随后循环中复性温度升到50℃，可保证前5个循环的扩增产物可在余下循环中进行指数式扩增；如果复性温度在40个循环中都保持在35℃，扩增片段重复性将很低。 2.4扩增产物检测与片段测序 扩增产物在变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，通常胶板35 cm×43cm，厚度0.8mm，每孔加样 8－20 微升，以保证单条带足够量回收。可使用同位素，也可采用银染技术；用2.0%的琼脂糖凝胶也可分析多态性，但分辨的条带较少。 对标记测序有可能获得更多的遗传信息。由于多数SRAP产生高强带，很少有重叠，而且引物较长，故比AFLP易测序。获得的SRAP标记差异片段，从胶上割下、回收后，用相应引物直接测序，必要时可采用克隆测序。 2.5 SRAP标记特征 由于在设计引物时正反引物分别是针对序列相对保守的编码区与变异大的内含子、启动子和间隔序列，因此，多数SRAP标记在基因组中分布是均匀的，通过利用RIL系构建的遗传连锁图也说明了这一点。同时发现在130个SRAP标记中，约20%为共显性，这种高频率的共显性则明显优于AFLP标记。 利用同一引物组合，从甘蓝类不同作物中（包括花椰菜、青花菜等）可获得多个SRAP标记。单个组合在每个个体中可检测到至少10条多态性谱带，其中一些为作物特异的；在不同的实验中多态性条带重复性极好。 SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域。25条多态性带中16条（64%）序列GC含量超过35%，表明可能是外显子部分；Blast搜索表明60%条带与已知基因序列高度一致，这就确认了SRAP产生的多数标记包含了可译框中的外显子。测序还表明SRAP多态性产生于两个方面：由于小的插入与缺失导致片段大小改变，而产生共显性标记；核苷酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生。 3. TRAP标记原理与方法
靶位区域扩增多态性 (target region amplified polymorphism，TRAP)也是一种新型的基于PCR标记，由美国农部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出。与SRAP、RAPD和AFLP等标记技术无须任何序列信息即可直接PCR扩增不同，TRAP技术是基于已知的cDNA 或EST序列信息。目前已获得许多物种基因组序列的丰富信息，包括人类、拟南芥，以及重要作物水稻和多种微生物的基因组序列草图绘制成功，有大量的EST序列可供使用，从而使得可以利用生物信息学工具和EST数据库信息产生出许多靶基因序列的TRAP多态性标记，而且极易将性状与标记相关联。 TRAP技术是从SRAP技术改进而来的。SRAP使用两个任意引物；而TRAP是使用长度为16~20核苷的固定引物（fixed primer）与任意引物(arbitrary prime)，固定引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来；任意引物与SRAP所用的一样，为一段以富含AT或GC为核心、可与内含子或外显子区配对的随机序列。固定引物的设计步骤为：从EST数据库中鉴别所需序列，再采用有关引物设计软件（如Primer3等） 设定核苷酸序列合理长度（18碱基）与最适、最大和最小Tm值（53、55、50℃），最后选定最适的引物; 任意引物设计完全同SRAP技术。TRAP-PCR反应条件与SRAP-PCR完全一致。每次TRAP-PCR反应在6.5%聚丙烯酰胺测序胶可产生50－900bp的片段30-50 个。 4 应 用 SRAP分子标记系统最早是在芸薹属作物开发出来。目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱桃、柑橘与芹菜中也成功扩增。TRAP技术是在向日葵中开发的，目前已成功应用于其他作物如水稻、菜豆、大麦、小麦、甜菜。主要用于种质资源的鉴定评价、遗传图谱的构建、重要性状基因标记、gDNA与cDNA指纹分析乃至图位克隆等方面。 4.1种质资源的鉴定评价 由于在不同物种、不同个体间具有一定的多态性，SRAP技术也成功应用于种质鉴定与评价工作中。Ferriol等（2003）对甜瓜（Cucurbita pepo）的2个变种69份类型代表性材料遗传多样性进行了SRAP、AFLP标记与形态学分析，结果表明，与形态学变异及类型的进化历史一致性方面，SRAP标记提供的信息比AFLP标记更优良；11个SRAP引物组合获得88条可重复的条带，平均8条，其中64条（72.7%）为多态，大小在154-653bp 之间；测序发现多个标记序列与已知cDNA或EST高度同源。另外还利用SRAP标记对笋瓜（C.maxima）19 份种质及8份南瓜属材料遗传多样性进行分析，24个引物组合产生的114个标记中多态性占33%，虽然低于RAPD比例，但聚类分析与主坐标分析表明，SRAP标记分析可将材料按照使用类型（食用、饲用、观赏用）来分组。因此，在对育种目标性状的评价方面，明显优于RAPD标记。 野牛草（Buffalograss）生长缓慢、耐旱、耐瘠、抗虫，倍性多样，遗传基础广泛。Budak等利用SRAP标记分析了buffalograss的43个基因型遗传多样性，结果也表明SRAP是一个评价遗传多样性、品种鉴定和系统发生的有效工具。 向日葵属野生种在栽培品种遗传改良方面很有价值，对于重要病害，尤其是霜霉病是很好的抗源，但大部分野生种是多年生，从野生种中鉴定基因非常困难。Hu等设计了与向日葵EST数据库中编码富含亮氨酸重复（LRR）类似蛋白序列配对的固定引物，利用TRAP标记分析，对向日葵属16个野生种及其2个杂交种的遗传变异性进行评估。结果表明TRAP标记可用于评估向日葵的遗传多样性，材料的聚类结果与经典分类相一致；其中一个TRAP引物结合到与抗病性有关的基因序列。表明TRAP技术将在种质基因型鉴别和重要目的农艺性状的基因标记方面存在广泛的应用前景。 4.2 遗传图谱构建 利用collard × cauliflower形成的RIL86个群体，构建了由130个SRAP、120个AFLP标记组成的遗传图谱。类似AFLP标记，SRAP均匀分布平衡在9个重要连锁群上。高频率共显性与在基因组中均匀分布的特性将使其优于AFLP标记而成为一个构建遗传图谱的良好标记体系。 4.3 绘制基因组转录图谱（transcriptome map）
转录图谱（transcriptome map）是进行比较基因组学研究极为有效手段。利用基于PCR的cDNA-SRAP分析来检测编码区的多态性将简便、高效、快捷。利用花椰菜DH植株与青花菜杂交产生的F2群体88个单株，使用48引物组合，从88个cDNA中检测到281个多态性cDNA -SRAP标记，平均每个引物对产生6个，21.1%为共显性；构建了由247个标记组成的转录图谱。利用这个图谱，成功进行了甘蓝类蔬菜作物与拟南芥基因组的基因排列与组成分析，发现这两类基因组的广泛同一性，在190个多态性cDNA-SRAP标记中，共有169个相似序列；这种同一性集中在某些染色体片段而非整个染色体上；甘蓝中大多数重复区段集中对应于拟南芥1号与5号染色体，而不是2号与4号染色体。 4.4 重要性状基因标记 重要农艺性状基因紧密连锁标记的获得，将可进行性状分子标记辅助选择，提高育种的选择效率与预见性，加快新品种的选育进程。常用的标记作图群体有F2、BC1、DH、RIL等，标记策略有BSA、NIL以及GRA等。BoGLS-ALK基因是十字花科中调节脂肪族芥子油糖苷脱饱和基因。利用RIL群体，采用SRAP技术，将该基因定位到连锁群L1，距显性标记SRAP133 1.4cM。 Li等于2003年在大白菜中也发现了一个与雄性不育基因有关的SRAP标记，在油菜中筛选到一个与Rf连锁的SRAP标记，在芹菜中获得一个与病毒抗性基因紧密连锁的SRAP标记。 4.5 SRAP标记测序与基因克隆 多数SRAP标记包含了可译框中的外显子，这为特定性状基因的分离克隆提供了极大方便。进一步测序与Blast分析发现，通过RIL群体获得BoGLS-ALK基因的显性标记SRAP133 与拟南芥中BAC克隆F4C21中一未知基因的可译框高度同源，该基因位于5号染色体上，此基因座已经定位了一个去饱和基因。据此推测标记SRAP133也在这个基因内部。 综合运用拟南芥相关基因序列信息，应用SRAP技术对青花菜BAC克隆测序，最终克隆了芥子油糖苷合成途径中一关键基因BoGLS-ELONG。 Li等利用SRAP技术获得一个与BoGLS-ALK基因共分离的标记，再用此标记序列来筛选青花菜BAC文库的一个BAC克隆，成功分离到BoGLS-ALK基因；并通过遗传转化导入拟南芥，进行了该基因的功能分析。同时正在从结球白菜的花粉母细胞、减数分裂期的花蕾分离出mRNA，进行cDNA的SRAP指纹图谱分析，以期克隆一些特异表达的基因，并初步获得PMC特异表达的基因。 |
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