生物

1、生物技术：指以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类提供商品和服务的一个综合技术体系。

2、基因工程：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程。

3、蛋白质工程：在基因工程技术对编码蛋白质的基因了解的基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。

4、限制性核酸内切酶(restriction  endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

5、转导作用transduction：通过病毒介导发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组。

6、基因文库的构建：用限制性内切酶对DNA酶解，然后把酶解的片段克隆进载体，再对重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定，整个过程称为基因文库的构建。

7、分子杂交：不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在局部碱基互补片段，而在复性时形成杂化双链（heteroduplex），此过程称分子杂交。

8、基因表达：细胞在生命过程中，把蕴藏在DNA中的遗传信息经过转录和翻译，转变成为具有功能的蛋白质分子的过程称为基因表达 (gene expression) 。

9、融合蛋白：外源蛋白在异源宿主细胞中含量通常很低，因此其会被宿主细胞降解。将要表达的外源蛋白与一个宿主的蛋白共价结合形成融合蛋白。

10、非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸，因此要求翻译起始氨基酸位点ATG必须位于要表达的外源基因片段的5’端，终止密码子必须位于要表达的外源基因片段的3’端。

11、外源蛋白质的复性：指变性的包含体蛋白在适当的条件下折叠成有活性的蛋白质的过程。包括表达蛋白中二硫键的正确形成和正确空间构象的形成。

12、寡核苷酸介导的诱变（定点诱变）：在DNA水平上改变氨基酸的编码序列，若蛋白的三级结构已经由X射线晶体衍射或其他方法测定，则较容易判定应改变哪个氨基酸以获得预期的性状。

13、现代发酵工程的主体是利用微生物，特别是经DNA重组技术改造过的微生物来生产商业产品,或直接把微生物应用于工业生产过程中的一种新技术。

14、罐批发酵：在灭菌的培养基上接种相应的微生物，然后不再加入新的培养基。

15、补料分批发酵：发酵过程中在不同时期加入越来越多的营养物，但不除去旧的培养基，使培养基的量逐渐增大，可以延长对数期与静止期的持续时间，增加生物量的积累，也能增加静止期的细胞代谢产物的积累。

16、连续发酵：在发酵过程中不断加入新鲜的培养基，同时除去等体积的旧的含悬浮的微生物的培养基。

17、浮集法收集：利用高压或电解可以产生大量的微小气泡，当有长链脂肪酸或胺存在时，气泡可以稳定存在相当长的时间。在适当条件下，细胞就可以被这些气泡所吸附而停留在泡沫层中。只收集泡沫层，改变条件去掉气泡，就可以得到需要的微生物细胞。

18、生物农药：指由生物体产生的具有防治病、虫害和除杂草等功能的一大类物质的总称。它们大多数是生物体的代谢产物，包括微生物杀虫剂、农用抗生素制剂和微生物除草剂等。

19、抗生素：指由生物（包括微生物、植物和动物）在其生命活动过程中所产生的活性物质，这类物质能以极小的浓度选择性地抑制或杀灭其他微生物或肿瘤细胞、抑制酶的活性、杀虫或刺激作物生长。

20、生物除草剂：是指使用杂草的天敌或杂草的致病物质来防治杂草，使杂草的密度降低到经济上能够容许的水平，但并非是根除杂草。

21、细菌素：指一种细菌的某些株系所产生的对该种细菌的另一些菌株或关系较近的其他细菌有杀伤作用、非复制性的含蛋白质的抗菌物质。

22、生物净化：利用生物来除去环境中的生物垃圾和有毒物质的过程。

23、微生物蛋白：又称单细胞蛋白（SCP） ，是从纯培养的微生物细胞中提取的总蛋白，可以作为人或动物蛋白的补充。

24、复合穿梭载体：即把不同生物来源、控制各种有用特性的遗传元件集中在一起构建穿梭载体，使之可以在特定细胞的特定条件下工作。

25、血影细胞：指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗等条件下发生溶血，使血红蛋白大量溢出，仅剩下细胞膜包被的细胞核结构。

26、基因枪法：通过高压气体等动力，高速发射包裹有重组DNA的金属颗粒，将目的基因直接导入受体细胞，整合到染色体上，并从这些细胞再生出完整的植株。

27、转基因动物：用实验导入的方法使外源基因在染色体基因组内稳定整合，并能遗传给后代的一类动物。

28、基因敲除：利用基因定向插入某一内源基因而破坏其功能的方法，来研究某一特定基因在发育过程中的功能。

29、抗体：淋巴细胞经诱导产生的特异蛋白，在其他免疫蛋白的帮助下与外来物质结合，抵消其生物学功能，保护自己不受有毒物质和病原菌的侵害。

30、抗原决定簇：对于一个免疫刺激，每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。

31、单克隆抗体：通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。

32、抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的融合蛋白具有新的特性。

33、现代分子诊断技术：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接探测基因结构及其表达水平，从而对疾病作出诊断的方法。

34、疫苗：利用微生物及其代谢产物，经过人工减毒或灭活或基因工程等方法制成，用于预防疾病的自动免疫制剂。

35、基因工程疫苗：利用现代基因工程技术将有效的特异性抗原基因插入易于增殖的载体，在载体增殖时可表达有效特异性抗原，取之作为疫苗。如基因工程乙肝疫苗。

36、亚基疫苗：单纯的外壳结合蛋白即可以在受体内激发成足够多的抗体，因此可以利用病原物的某一部分制得的疫苗。

37、DNA免疫：又称基因免疫，系指将靶抗原编码基因置于真核表达调控元件的调控下，将该质粒DNA直接进行动物体内接种，并以与自然感染类似的方式呈递抗原，诱生特异性体液和细胞免疫应答的新理论和技术。

38、基因芯片（DNA微阵列）：通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究。

1、以PBR322为例，说明如何筛选阳性重组子？

           BamHI片段(Tcr)

PBR322

           PstI(Apr)片段                          重组分子I

             PstI片段     重组分子Ⅱ(Aps Tcr)      (Apr Tcs）

外源DNA

             BamHI片段

重组分子Ⅰ    分别转化E.coli      涂布Ap平板           Apr转化子

重组分子Ⅱ      (ApS TcS)         涂布Tc平板          Tcr转化子

        影印到Tc平板上        Apr TcS为重组子   Apr Tcr为原载体

        影印到Ap平板上        ApS Tcr为重组子   即为非重组子

2、作为理想载体，质粒需具备那些条件？ 

（1）具有松弛型复制子；           

（2）在复制子外存在多克隆位点；

（3）具有插入失活的筛选标记；     

（4）分子量较小，拷贝数较高。

3、限制性内切酶识别顺序和酶切位点

（1）识别４-8个相连的核苷酸；   

（2）富含GC；

（3）对称性------双对称；         

（4）切点大多数在识别顺序之内，也有例外；

（5）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-P和３’-OＨ。

4、叙述用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子的过程。

使用tetr作报告基因分离功能启动子

（1）首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind Ⅲ位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。

（2）将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。

5、若克隆的基因有罕见密码子，如何提高蛋白表达量。

（1）如果罕见密码子在目的基因中出现频率低：利用密码子的简并性，对外源基因进行定点突变，将罕见密码子突变为宿主常用的密码子，但不改变基因所编码的氨基酸序列。

（2）若目的基因中的罕见密码子含量较高：通过基因工程的方法，将编码识别罕见密码子的tRNA的基因转入细菌细胞中，从而使转化后的细菌能够大量地转录可识别罕见密码子的tRNA。

6、叙述双质粒系统作用原理。

（1）用trp启动子带动编码cI阻遏蛋白的基因,并将它们置于一个低拷贝的质粒上；

（2）将要表达的基因置于PL启动子的下游,使其表达受PL启动子的调控。

（3）把这两个质粒同时转入宿主细胞，当培养基中没有色氨酸时， trp启动子启动，合成cI蛋白，PL带动的外源基因则不表达；

（4）如果向培养基中加入色氨酸， trp启动子则关闭，没有cI蛋白合成， PL启动子带动的外源基因就可以表达了。

7、叙述一种基因诱变的方法。

重叠延伸诱变:

合成4个引物，包括两个含有突变碱基的突变引物，这两个引物反向部分重叠；另两个引物分别和目的基因的两端互补（通用引物）；

引物两两配对，分两管进行第一次PCR，产生两个部分重叠的DNA片段；

将上述两管PCR产物混合，变性再复性，含有重叠部分的DNA 片段可以配对，然后在DNA聚合酶的作用下延伸产生完整的双链DNA（延伸的4个组合中只有一种可以产生可延伸的3’-OH ）。

除去多余引物，用一对通用引物，以新合成的完整双链DNA为模板进行第二次PCR，可得到含有预期突变位点的DNA片段。

8、简述重组蛋白药物生产的主要步骤?

提取蛋白质→纯化→测氨基酸序列→推导DNA序列→人工合成DNA序列的探针→从文库中筛选cDNA基因→克隆入表达载体→高效表达→分离纯化产物

9、叙述现代发酵工程流程?

菌种的选育→培养基的配制→灭菌→扩大培养和接种→发酵过程→分离提纯

14、DNA疫苗的优越性 

1）DNA比蛋白质稳定，可以保存较长的时间；

2）DNA的提取和纯化也比蛋白质容易，适合大规模生产；

3）DNA片段可以插入质粒中制成疫苗，而且在一个质粒上可以同时容纳多个抗原基因。因此可以一次注射就获得多种免疫能力；

4）DNA疫苗对于一些目前难以用常规疫苗防治的疾病的预防和治疗有重要意义。

10、简述限制性内切酶PstⅠ的生产流程?

   PBR322       HindⅢ酶解       P.stuartio的核DNA

                   重组

噬菌体    侵染

                   转化大肠杆菌

                          产生抗性

            对噬菌体有裂解作用的转化子            有限制性内切酶基因，培养

                PstI内切酶活性检测

               检测PstI甲基化酶活性

11、如何在串联的气升式反应器中完成T4连接酶的大规模生产。

把大肠杆菌菌株NM989放在两个生物反应器中分别生长和进行诱导，细胞悬液从生长阶段到诱导阶段的流动通过管子相连，由泵控制：

§ 生长阶段：30℃，外管气升式反应器体积为10L，此阶段连接酶基因不表达；

§ 诱导阶段：42℃，反应器体积为5L，此阶段可以特定速率取出细胞用于下游纯化。

12、如何改造苏云金杆菌菌株，使其在营养生长阶段表达毒素蛋白？其依据为何？

    苏云金杆菌只在孢子形成阶段才合成苏云金杆菌前毒素蛋白。若将该基因在营养生长时期就转录和翻译，就可以通过连续发酵生产毒素，降低生产成本。

苏云金杆菌的孢子形成过程中，有一个特定的转录因子（σ因子），可以与此时期活跃的基因的启动子相互作用，启动它们的转录。

苏云金杆菌的毒素基因的启动子就是在这一转录因子的调控下，只在孢子形成时转录；如果用一个营养时期活跃的启动子带动基因表达，则苏云金杆菌的毒素基因就可以在营养生长阶段表达。

13、如何分离固氮相关基因？

遗传互补法。从野生型固氮基因文库中坚定分析能使各种突变体恢复固氮能力的克隆。分别将光谱宿主克隆载体和固氮菌株的总DNA用限制性内切酶酶解，将酶解后的两者连接，转入大肠杆菌中，筛选构建野生型微生物的基因文库A，同时用诱变剂处理微生物细胞，筛选出无氮不生长的突变型微生物B，将AB接合，在不含氮的培养基上，筛选、提取生长的菌落的DNA即可得到。

15、如何获得结瘤作用基因？

遗传互补法，即用野生型苜蓿中华根瘤菌的基因文库转化不能结瘤的苜蓿中华根瘤菌突变体（nod-），然后筛选出可形成根瘤的重组根瘤菌：

（1）建立野生型苜蓿中华根瘤菌的基因文库

（2）基因文库包装入λ噬菌体并引入大肠杆菌，经结合作用进入苜蓿中华根瘤菌突变株（nod-），载体上的四环素抗性基因可作为选择标记

（3）培养转化后的苜蓿中华根瘤菌并检验它们在根上形成根瘤的能力

（4）从能形成根瘤的苜蓿植株的根瘤中分离苜蓿中华根瘤菌，找到载体上的插入片段，进行亚克隆和进一步分析

（5）以分离到的结瘤基因为探针，在基因文库中筛选与其相邻的DNA片段，来获得更多基因。

16、如何分离纤维素酶？

原核：1.从原核生物中克隆编码葡聚糖内切酶基因：

（1） 构建能分解纤维素的原核生物的核基因文库，在含有抗性选择性平板上培养宿主菌

（2） 菌落在含羧甲基纤维素的平板上37°培养，能够产生并分泌葡聚糖内切酶的菌落周围的羧甲基纤维素会被部分分解

（3） 水解区域可通过刚果红染色观察，呈红色

2.分离葡聚糖外切酶基因：采用免疫学方法筛选带有重组的葡聚糖外切酶基因的克隆

3.分离β-葡糖苷酶基因：构建能产生β-葡糖苷酶的微生物的核基因文库

17、酵母表达系统的优点有哪些？

（1）对其遗传学和生理学的研究较为深入，已获得全部基因组序列；

（2）酵母在小量和大规模的生物反应器中都能快速生长

（3）有几个很强的酵母基因启动子，其中酵母细胞内2μm质粒可作为内源表达载体；

（4）可以对蛋白进行多种翻译后修饰

（5）自然分泌蛋白少，纯化较方便

（6）具有较高的安全性（7）与高等真核生物非常相像。

18、获得转基因哺乳动物细胞的方法有哪些？

（1）借助于载体的基因转移：适用于哺乳动物细胞的载体，直接或与野生型病毒一起转染目的细胞。

（2）显微注射法：把目的基因用显微注射的方法直接注入目的细胞的细胞质或细胞核。

（3）磷酸钙介导的DNA导入：DNA与磷酸钙共沉淀后，DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒中，这种微型磷酸钙晶体可使目的细胞产生吞噬泡，并使吞噬泡的膜局部溶解，DNA由此进入细胞。

（4）电击法：将目的细胞与外源DNA共培养，向培养液施加一个瞬时高电压，使得目的细胞的细胞膜暂时出现孔洞，外源DNA即由此孔洞进入细胞。

（5）脂质体介导的基因转移：将外源DNA包裹在脂质体中，一起转入细胞。

（6）染色体介导的基因转移：用离心分离法或流式细胞仪分离法将染色体分离出来之后，以其为媒介将外源基因导入目的细胞。

（7）血影细胞介导的基因转移：先将外源DNA转入血影细胞，然后让血影细胞与受体细胞在适当条件下发生细胞融合，从而将外源DNA导入受体细胞。

19、酶联免疫吸附测定法基本原理

基本原理：测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，再加一抗与之相结合，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。

20、简述将DNA转入鼠的基因组的3种方法。

（1）反转录病毒法：利用逆转录病毒载体将外源基因转入胚胎早期细胞，然后移植到受体动物中。

（2）DNA微粒注射法：利用微注射法将DNA直接注射入受精卵的精前核中。

①向供体雌鼠注射怀孕母马的血清，48小时后再注射人的绒毛膜促性腺激素，使其超量排卵，增加用于微注射接种DNA的受精卵数量；

②雌鼠交配后取出受精卵，将外源基因注射进受精卵中；

③将注射后的受精卵用显微外科手术移植到假孕雌鼠的子宫内，大约3周后，接受过注射的受精卵发育生长为幼鼠，由代孕母鼠产下。

（3）胚胎干细胞法：将基因工程改造过的胚胎干细胞导入早期胚胎。

21、简述单克隆抗体制备过程。

（1）将抗原注射给实验鼠后取出B淋巴细胞；

（2）B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合、筛选出杂交瘤细胞培养；

（3）筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞细胞群，进行老鼠体内培养，再从其腹水中提取，所得即为单克隆抗体。

22、如何在重组噬菌体中生产抗体，同时使蛋白表达为附着型或分泌型两种？

  从分离的淋巴细胞中提取mRNA      在丝状噬菌体的外壳蛋白Ⅲ基因和外源抗体蛋白基因之间插入一个琥珀突变密码子UAG

      mRNA逆转录为cDNA                                     丝状噬菌体

                                                    感染   

通过PCR扩增重链和轻链                         突变的菌株       非突变的菌株

              

用一套特别的限制性内切酶酶解                突变密码子UAG     突变密码子UAG

                                                 读为               读为

将重链序列克隆到     将轻链序列克隆到            谷氨酸Glu         终止密码子

重链丝状噬菌体载体中 轻链丝状噬菌体载体中

  将重链和轻链重组到一个丝状噬菌体载体中           融合蛋白        分泌型蛋白

  用抗原结合筛选噬菌斑

23、逆转录病毒载体介导基因转移的一般过程：

1）目的基因克隆到逆转录病毒载体上；

2）带有目的基因的逆转录病毒载体通过物理方法如电穿孔法导入已选定的包装细胞；

3）根据载体所提供的筛选标记基因筛选转化细胞；

4）选择具有高滴度重组病毒的转化细胞，分离重组病毒；

5）重组病毒感染靶细胞，采用两种方式，一种是以无细胞带病毒上清和靶细胞一起温育；另一种以产病毒包装细胞经射线照射致死后作为饲养细胞，被靶细胞在其上培养达到目的。

6）如采用体外感染，则将感染的细胞回输体内，分析治疗基因的表达及治疗效果；

7）病毒感染的质量控制，在基因转移过程中要进行严格的质量控制。