CRISPR/Cas 是进行基因编辑的强大工具,可以对基因进行定点的精确编辑。在向导 RNA(guide RNA, gRNA)和 Cas9 蛋白的参与下,待编辑的细胞基因组 DNA 将被看作病毒或外源 DNA,被精确剪切。 一、寻找目的基因的靶标 使用在线设计网站 CRISPR direct,如需直接复制网址,可在生物学霸后台对话框回复 direct 即可。 靶点挑选要点:
二、 插入片段设计 插入寡核苷酸序列设计(必须 PAGE 纯化寡核苷酸): 正向序列 5’ACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTT3’ 反向序列 3’TGTGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAATCTCGATCTTTATCGTTCAATTTTATTCCGATCAGGCAA5’ 插入片段的合成
三、 pCas9/gRNA 基因敲除载体的构建 用 EcoRV 酶切 2 μg pCas9/gRNA 载体(inovogen)。通常情况下用大约 20~30 单位的酶大约 3 小时可以酶切完全。酶切后我们建议用琼脂糖凝胶回收线性化载体。将回收后的线性化载体定量,通常线性化载体的工作浓度为 50~100ng/μl。连接用水将退火后双链寡核苷酸 (10 μM) 稀释 100 倍备用。 连接反应体系: T4 DNA 连接酶 5U EcoRV 5U 线性化载体 2 μl 稀释 100 倍后双链寡核苷酸 1 μl 10× 连接酶 Buffer 1 μl 50% PEG4000 1 μl 加水补足 10 μl 反应条件: 22℃ 30 min, 37℃ 15 min。 注:
四、 转化大肠杆菌感受态细胞及通过载体上的引物进行 PCR 鉴定阳性克隆 挑选阳性克隆进行测序验证, 验证正确后, 提取质粒进行转染试验, 关于 sgRNA 是否有效。可以转染之后,直接提取 DNA,通过测序验证,如果在靶标位点附近开始出现杂乱的多峰说明是 sgRNA 有效,如果没有则该 sgRNA 无效。 相关 Protocol Cas9 基因敲除技术详述 基因敲除常见方法 基因敲除的原理与方法 条件性基因敲除的策略 作者:小小左 |
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