背景Crispr/Cas9在微生物中起到的作用就是识别入侵、将病毒的DNA录入自己的基因组，当病毒再次入侵时候，切割病毒DNA、RNA进而消除病毒的感染。CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个细菌免疫系统，细菌地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。 原理结构Crispr在编辑基因的时候，需要2个成分①Cas9核酸酶；②gRNA（全称是guide RNA，引导RNA）（需要设计里面的部分序列）。 Cas9其中Cas9核酸酶的基因已经被整合到商业化载体中，因此使用者只要自行设计sgRNA，然后构建Cas9/sgRNA表达载体，转染细胞，就可以行使基因组的定点基因编辑任务。 sgRNA结构gRNA（guided RNA）是CRISPR基因敲除敲入系统中重要的组成部分，由两部分组成，分别是tracRNA和crRNA。其中crRNA引导cas9定位到要编辑的DNA序列附近，它有一段序列与tracrRNA的一部分是同源的，因此这两者可以部分结合。 tracrRNA的作用在于：形成一个茎环结构，与Cas9蛋白结合，示意图如下所示： 
将上图的细节放大（图片来源于Sigma），如下所示： 
如何发挥作用Cas9和gRNA会形成一个Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。这个RNP就能结合到基因组上的靶序列上。而基因组上的靶序列如果要被切割，需要满足两个条件： 第一，gRNA与基因组上有17-21个碱基的同源区，也被称为protospace。 第二，靶序列附近有PAM（protospacer adjacent motif），需要注意的是，在设计gRNA时，PAM并不是gRNA的一部分，找公司合成的gRNA时，里面是没有PAM序列的。 作用示意图如下所示： 在tracrRNA引导下，gRNA与基因组上的靶序列结合，进而RNP切割靶序列，形成一个DSB。 下图是Takara官网的原理示意图： 
阶段 1：外源 DNA 采集外源核苷酸是通过Cas 蛋白识别，入侵的短片段DNA（30-50个碱基对）被称为protospacers，作为间隔序列插入宿 主CRISPR 位点中，由重复序列隔开。对于I型和II型系统来说，protospacers来自入侵 DNA 中两侧出现2-5 个核酸结构（PAM，protospacer adjacent motif）的区域。一般 protospacers 连接在CRISPR 位点的一端，并且后者通过涉及 Cas1、Cas2 和 游离3’-hydroxyls 等元件的机制，牵引序列。Protospacer 的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制，这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。如下所示： 阶段 2：crRNA 合成CRISPR RNA 在转录之后，生成初级转录产物：pre-crRNA，之后经过加工，又成为一组短小的 CRISPR衍生RNAs（crRNAs），这些crRNAs 每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。 阶段 3：靶向干扰在pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活tracrRNA(Trans-activating crRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(Protospacer Adjacent Motif)的5’-GG-N18-NGG-3’特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。 补充：cas9解螺旋的过程Cas9可以解开DNA，gRNA和target dsDNA配对是在解旋之后所进行（文献为：Sternberg, S. H., et al. (2014). “DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9.” Nature 507(7490): 62-67.）。步骤如下：
下图是Doudna那篇paper的原理解释的figure 
sgRNA的序列特征和设计sgRNA的序列设计原理gRNA 设计靶序列选择：在NCBI找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子。可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果被敲除的靶标基因是microRNA或者lncRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。 gRNA设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到PAM序列：NGG（N代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游20 nt即可 （如下图所示）。 从前面的原理中可以知道，这个gDNA是与基因组上的正义链是相同的。 目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全敲除一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas系统诱导产生indel）。
因此我们一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域。另外，通常一个基因往往会转录成2个以上的转录本，所以请选择尽量靠近5’端的公共部分，保证每个转录本都会成功移码突变。 通常情况下，为了便于下游KO mutants的鉴定，我们往往可以作如下设计：即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少100 bp内酶切位点唯一（下游的敲除突变也能通过测序的手段来鉴定）。 上图的酶切示意图就显示了，敲除突变无法被酶切，而野生型的则能够进行酶切。 不过现在已经有了很多在线的gRNA设计工具，现在就以其中的一个为例说明一下。 sgRNA的载体连接现在已经有很多可以设计gRNA的工具，这里直接略过，直接看后文中所附的gRNA设计工具即可。 我们实验室自己使用的是
因此，在合成gRNA的两条链时，正义链上的oligo序列前面要加一个 例如我们最终确确定的gRNA序列为 那么最终需要合成的序列有2条：oligo1：5’-caccGCTGTTTGTGCAGGGCTCCGA -3’； oligo2：5’- aaacTCGGAGCCCTGCACAAACAGc-3’。加粗部分与经BbsI酶切后的载体互补配对，BbsI的酶切位点如下所示： BbsI酶的信息如下所示： 全称：BbsI-HF 货号：R3539 保存条件：负20度 缓冲液：CutSmart Buffer（NEB带有HF（即High Fidelity）字样的酶都支持CutSmart） cas9基因编辑案例分析这个案例来源于Takara官网案例。 目标序列DNA的 这里需要注意几点： 第一：寻找靶序列中的PAM序列，也就是NGG，我们需要注意的是，PAM序列并不是gRNA的一部分，因此在合成gRNA时，里面是没有PAM序列的； 第二：RNP在切割靶序列时，是可以切割任意一条链的DNA的（可能是正义链，也可能是反义链，总之在做敲除时，最终目的就是破坏DFNA）。 
上图的流程是分三步：
文献案例再来看一个文献中的案例： 文献信息如下所示：
文献中是使用了cas9编辑了斑马鱼的etsrp基因，文献中的示意图如下所示： 
红色方框画的就是靶序列，在Ensembl数据库中检索斑马鱼的etsrp外显子2序列，如下所示：
导入Snapgene，标记出来gRNA序列，如下所示： 
从上图可以看到，这个gRNA序列就是位于正义链上。 实验流程载体构建流程1. Oligo退火形成duplex
PCR仪 95℃ 5 min，缓慢降温至室温1h，1：200稀释duplex。 2. 质粒酶切
加入以上成分，于37摄氏度酶切15分钟（不同的酶有不同的酶切时间，这个要看说明书）。此处使用的Cas9载体的gRNA插入位点如下所示： 
mark 3. 胶回收 大片段约11kb 回收，回收后的线性片段要放到负80度冰箱，因为 4. 连接
室温连接4-6h，随后转化，转化时要把所有的连接体系加入到感受态中，因为载体的连接效率不高。 病毒包装体系
如果是使用Lipo3000进行病毒包括，则整个包括体系如下所示：
注：注：（1）包装质粒PAX2 ：pMDG2：和目的基因质粒=3:2:5，因此前期工作，每种质粒的浓度最好为：[1]psPAX2（500ng/μL）[2]pMD2G（500ng/μL）[3]目的质粒（500ng/μL） 转染转染条件与常规的病毒转染相同。 转染48h后，加入puromycin来筛选细胞，1mL的培养基，加5μL的嘌呤酶素（1mg/mL），也就是说嘌呤霉素的终浓度是5μg/mL。 测序加了嘌呤霉素的培养基要每天更换，每次里面都要含有5μg/mL的嘌呤霉素，这个时间要持续7天。在第7天的时候，取一定数量的细胞，提取DNA，测序，这一步的目的主要在于，确定是否存在有基因敲除的细胞，如果没有，就要重新包病毒进行敲除。 如果存在基因敲除的细胞，那么gRNA切割位点处就会产生套峰，表示有效编辑的效应为50%，如下所示： 
单克隆的获取当测序结果出现套峰时，表明这批细胞中存在被敲除的细胞，此时就可以分离单克隆了，分离单克隆主要有下面的几种方法。 有限稀释法有有限稀释法的过程为：收集细胞，计数，将细胞的密度稀释为500个/mL，此时，用20μL移液枪吸取细胞悬液先点几个孔 ,每孔约2μL，然后放在倒置显微镜下观察 ,如每孔 1～2 个细胞，说明细胞浓度合适 ，则可一次点完 96 孔板，每个孔100uL。 这个过程也可以使用流式细胞仪分选，直接分到96孔板中，每孔种1个细胞。 直接挑单克隆
单克隆的鉴定 第一种方法，根据设计，推荐使用酶切鉴定的方法（见设计部分），通量高； 第二种方法，就是提取细胞DNA，跑胶，在gRNA序列的上下游设计一对引物，产物长度约500bp，敲除的细胞的条带会缩减，由于gRNA只有20几个bp，因此普通的琼脂糖凝胶不容易看出差异，此时可以采用SDS凝胶，如果敲除的基因是非编码的序列，那么就采用测序法； 第三种方法，测序，如果不熟悉SDS凝胶，可以采用普通的琼脂糖凝胶，直接切胶，送测序； 第四种方法，如果有抗体，可以使用WB的方法。 gRNA设计网站收集
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