CRISPR/Cas9是第三代“基因组定点编辑技术”。利用CRISPR酶对人类DNA进行切割,能够人为的有效改变人类DNA的变化和突变,从而达到基因治疗疾病的目的。 CRISPR-Cas9基因编辑技术与前两代技术相比,以其简易、高效和多样化的特点迅速成为生命科学最热门的技术,迅速风靡于世界各地的实验室,成为科研、医疗等领域的有效工具。CRISPR/Cas9技术被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因, 特别是用于人类疾病的相关基因治疗中,被誉为现代人类医学最具潜在变革性的创举之一。 CRISPR/Cas9基因编辑技术应用广泛,在各个生物生物领域都有涉及,如:
CRISPR/Cas9 system是 crRNA(CRISPR-derived RNA )通过碱基配对与 tracrRNA (trans-activating RNA )结合形成 tracrRNA/crRNA 复合物,此复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。 Cas9 蛋白是一种双链DNA核酸酶,能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似,但它不需要形成二聚体才能发挥作用。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA 两条单链。Cas9 首先与crRNA 及tracrRNA 结合成复合物,然后通过PAM(protospacer-adjacentmotif)序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA 复合结构,进而对目的DNA 双链进行切割,使DNA 双链断裂。通过人工设计改造形成具有引导作用的sgRNA (singleguide RNA ),足以引导 Cas9 对 DNA 的定点切割。 PAM是由3个成对碱基构成的序列,靠近靶DNA序列3' 末端,序列结构为5’-NGG-3’,在所有的基因中可以大量找到靶点,因此得到广泛的应用。 人类基因组中平均每8bp即可出现一个PAM sgRNA设计方法 利用CRISPR/Cas9 进行基因的编辑,首先要构建有效的 sgRNA。一般地,基因特异的 sgRNA 模板序列为位于 PAM 序列前间区序列邻近基序。这是一种见于 crRNA 分子的短核苷酸基序,可以被 Cas9 蛋白特异性识别并切割的 20 个 nt。而 PAM 序列的特征为 NGG(其中 N 为任意核苷酸)。 设计网站:http://crispr./ sgRNA 设计一些要点:
CRISPR/Cas9 基因编辑流程 确定基因编辑类型 对基因组进行基因编辑,首先需要确定我们要进行的基因编辑类型,基因编辑类型一般包括敲除,敲入,修饰和点突变。CRISPR/Cas9 基因编辑需要在细胞核内存在含有靶点gRNA及Cas9 蛋白形成的RNP 复合体。可以选择基因编辑质粒载体、病毒、体外转录gRNA 和Cas9 mRNA、化学合成gRNA和表达纯化的Cas9 蛋白。如图: 吉玛基因gRNA载体类型及用途简介
pU6gRNACas9EGFP载体说明及用途:同时表达gRNA和Cas9,可以对基因组单位点进行断裂;表达GFP可确定转染效率并用于富集转染成功细胞。 LV1-gRNA载体说明及用途:该载体用于慢病毒包装,包括GFP原件,表达gRNA,可用于针对已经稳定表达Cas9的细胞或物种的基因编辑。 LentiV2-gRNACas9puro载体说明及用途:该载体用于慢病毒包装,包括puro原件,表达Cas9,可用于构建稳定表达Cas9细胞株。 pT7-gRNA载体说明及用途:T7启动子后接gRNA,插入靶序列后,可以用于体外转录得到gRNA。 |
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